0. Opening
3월 2일 목요일부터 매주 2시간씩 Bioinformatics 데이터 분석을 배우게 되었다.
일단은 GEO 등에서 공개된 데이터를 이용해서, data 전처리부터 R을 이용한 통계처리까지 해보는 것으로 이야기되었다.. 추후에 박사님이 실험데이터를 얻으면 그 데이터를 이용해서 스터디가 진행될 수도 있다.
아마 ATAC-Seq, ChIP-Seq 데이터를 먼저 얻을 것이기 때문에 ATAC-Seq과 ChIP-Seq 데이터 처리하는 것을 먼저 배우게 될 것이고, 교수님이 시간적 여유가 된다면 RNA-seq이나 MNase-seq 데이터도 처리하는 법을 배우지 않을까 싶다.
따라서, 당분간은 주로 ATAC-Seq에 관련된 글을 포스팅할 것 같다.
1. Data processing
① ATAC-seq
- Adapter trimming (cutadapt)
Sequencing을 하기 위해서는 adapter가 필요함. 하지만, sequencing이후 assembly과정에서는 adapter가 없는 순수한 DNA sequence가 필요함. 따라서, read말단에 존재하는 adapter를 제거하는 과정이 필요함.
- Genome alignment(bowtie2)
reference genome을 이용해 DNA 단편을 sequencing 후 다시 genome을 조립하는 과정. 해당 read가 어느 chromosome에 있는지 등을 파악.
- Sort & Index & Mark duplicate (samtools, biobambam)
duplication은 PCR을 이용한 library construction 과정에서 생김. 정말 우연찮게 똑같은 서열이 다른 위치에 있을 수 있지만 확률상 희박함. 이러한 duplication은 조립과정에서 도움이 되기보다는 편향의 원인이 됨. 하나의 read가 많은 것보다, 여러개의 read가 골고루 널리, 비슷한 양으로 있는 것이 이상적임.
- Create browser tracks and peak calling (MACS)
sequencing 데이터에서 peak는, 해당 지점에서 높은 신호 또는 강도를 가지는 신호의 꼭대기 지점을 의미. Peak는 주로 open chromatin(ATAC-seq), 단백질 결합 영역(ChIP-seq), 유전자 발현 제어 영역(RNA Sequencing) 등과 관련된 DNA sequence 구간.
- Make consensus peak list (R)
통계처리
- Sort and annotate (nearest TSS) consensus peaks (Homer)
ATAC-seq의 경우 peak를 나타내는 지점은 open chromatin으로 enhancer의 가능성이 높음. peak에서 가장 가까운 gene을 찾는 과정 (enhancer가 항상 gene과 가까운 것은 아니긴함..)
- Calculate motif accessibility (ChromVAR)
② RNA-seq
- Adapter trimming (cutadapt)
- Genome alignment (STAR)
- Sort & Index & Mark duplicate (samtools, biobambam)
- Read quantification (htseq)
2. File format
① FASTQ
- FASTQ format은 'AGCT'로 표현되는 생물학적 sequence와 아스키 코드 (ASCII) 문자로 표시된 각 염기에 대한 quality (Phred)score를 모두 저장하기 위한 Text-based format.
- 주로 NGS 기술로 생산된 sequencing raw data에 많이 사용
② Binary Alignment Map file (BAM file)
- sequence date를 저장하고 있으며, Binary형식으로 바로 열람이 불가능하다. 대신, 용량이 작다는 장점이 있다
- Header section과 alignment section을 포함하고 있음.
- Header: sample name, sample length, alignment method에 관한 내용을 포함
- alignment: read name, read sequence, read quality, alignment information, custom tags에 관한 내용을 담고 있음.
read name에는 chromosome, start coordinate, alignment quality, match descriptor string이 포함
③ pl
- pl파일은 perl 인터프리터를 사용하여 컴파일되고 실행되는 Perl로 작성된 스크립트
