CRISPR-Cas9 유전자 편집방법

허젠쿠이 박사가 유전자 쌍둥이에게 HIV 유전자를 제거했다고 했는데
보통 유전물질의 전달을 AAV 바이러스 벡터에서 진행한다고 합니다.
이때 의문이 생겼습니다. CRISPR-Cas9은 AAV 바이러스에 안 들어간다면서 어떻게 한거지? 그래서 궁금점들을 몇가지 정리했습니다.

1.유전자 편집기술은 박테리아에서 발견된 cas9을 사용했다고 하는데 이걸로 사람이나 동물 유전자는 어떻게 편집하는거지?

유전자 편집 기술에서 CRISPR-Cas9 시스템은 박테리아에서 처음 발견되었지만, 이를 통해 인간이나 동물의 유전자를 편집할 수 있는 이유는 Cas9 단백질과 가이드 RNA의 조합이 특정한 DNA 서열을 정확하게 인식하고 절단할 수 있기 때문입니다. 이 기술은 단순히 박테리아에서 유래했을 뿐, 원리 자체는 생명체에 상관없이 DNA를 타겟팅할 수 있습니다. 이제 이 과정을 설명해 드리겠습니다.

CRISPR-Cas9을 통한 유전자 편집 과정

1. 가이드 RNA(gRNA) 설계:
   먼저 편집하고자 하는 유전자 서열을 찾습니다. 특정 유전자 서열을 목표로 하는 가이드 RNA(gRNA)가 설계됩니다. 이 가이드 RNA는 약 20개의 염기쌍으로 이루어져 있으며, Cas9 단백질을 그 특정한 목표 DNA 서열로 인도하는 역할을 합니다.

2. Cas9 단백질과 결합:
   가이드 RNA는 Cas9 단백질과 결합하게 됩니다. Cas9은 가이드 RNA가 인도하는 대로 특정 DNA 서열로 이동하게 되고, 목표한 DNA 서열에 도달하면 Cas9 단백질이 그 DNA를 절단하게 됩니다. Cas9은 이중 가닥 DNA의 특정 지점에서 가닥을 절단할 수 있는 "가위" 역할을 합니다.

3. DNA 절단:
   Cas9이 목표 DNA 서열에 도달하면, 가이드 RNA의 서열과 상호작용하여 그 위치에서 DNA를 절단합니다. Cas9은 이중 가닥 DNA를 절단하기 때문에, 세포는 이를 수선해야 하는 상황에 놓이게 됩니다.

4. DNA 수선 및 유전자 삽입/변형:
   DNA가 절단된 후, 세포는 비상동성 말단 결합(NHEJ, Non-Homologous End Joining) 또는 상동성 재조합(Homology Directed Repair, HDR)과 같은 방법을 사용해 손상된 DNA를 수리하려고 합니다.

   • NHEJ: DNA를 서둘러 수선하는 과정에서 염기 서열이 추가되거나 삭제되며, 이로 인해 유전자가 비활성화될 수 있습니다. 이 방법은 유전자 기능을 제거하거나 비활성화할 때 유용합니다.
   • HDR: 외부에서 제공한 새로운 DNA 서열(템플릿)을 사용해 손상된 부위를 정밀하게 수선합니다. 이 방식으로 새로운 유전자를 삽입하거나 특정 돌연변이를 수정할 수 있습니다.

동물 및 인간 유전자 편집에서의 응용

CRISPR-Cas9 기술은 인간과 동물의 세포에서도 사용될 수 있는데, 그 이유는 모든 생명체의 DNA 구조가 기본적으로 동일하기 때문입니다. 박테리아에서 발견된 Cas9 단백질이 인간 세포에서도 동일한 방식으로 DNA를 절단할 수 있습니다. 이를 통해 인간이나 동물의 특정 유전자를 제거하거나, 돌연변이를 수정하거나, 새로운 유전자를 삽입할 수 있습니다.

• 인간 세포: 인간의 세포에 Cas9과 가이드 RNA를 도입하면, 특정 유전자의 돌연변이를 수정하거나 제거하여 질병 치료에 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 유전적 질환을 일으키는 돌연변이를 수정하는 데 사용할 수 있습니다.
• 동물 모델: CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 특정 유전자를 편집한 동물을 만들어 연구 목적으로 사용하거나, 가축에서 유전적으로 원하는 형질을 도입하는 데 사용할 수 있습니다.

유전자 편집의 도구 전달 방법

인간이나 동물 세포에 CRISPR-Cas9 시스템을 도입하는 방법도 매우 중요합니다. 일반적으로 다음과 같은 방법들이 사용됩니다:

1. 바이러스 벡터:
   Cas9과 가이드 RNA를 코드하는 유전자를 바이러스에 탑재하여 세포로 전달합니다. 이 바이러스는 세포 내로 침투해 유전자 편집 도구를 전달합니다.

2. 리포좀 또는 나노입자:
   화학적으로 합성된 나노입자나 리포좀을 사용해 Cas9 단백질과 가이드 RNA를 세포 안으로 전달합니다.

3. 전기천공법:
   세포에 전기 펄스를 가해 세포막에 일시적인 구멍을 내고, 이 구멍을 통해 CRISPR-Cas9 시스템을 세포로 도입하는 방법입니다.

결론

박테리아에서 유래한 Cas9 단백질을 이용한 CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술은 인간과 동물의 세포에서도 성공적으로 적용되고 있습니다. 이는 Cas9 단백질과 가이드 RNA가 특정 DNA 서열을 정확하게 인식하고 편집할 수 있는 능력 덕분입니다. 이를 통해 유전자 치료, 질병 연구, 그리고 유전 형질을 개선하는 다양한 분야에서 혁신적인 성과를 기대할 수 있습니다.

2.허젠쿠이 박사가 아이의 배아에 HIV를 유발하는 염기체를 삭제시킨 적이 있잖아 이건 어떻게 한거야?

허젠쿠이 박사는 2018년에 CRISPR-Cas9 기술을 사용해 두 명의 쌍둥이 여아의 배아에서 CCR5 유전자를 편집했습니다. 이 유전자는 HIV 감염과 관련이 있으며, 이 유전자가 비활성화되면 바이러스가 세포에 침입하지 못하게 됩니다. 그 결과로, 허젠쿠이 박사는 이 쌍둥이들이 HIV 면역을 가지게 되었다고 주장했습니다. 그러나 이 실험은 많은 논란과 윤리적 비판을 불러일으켰습니다.

이 사건에서 사용된 CRISPR-Cas9 기술을 통한 유전자 편집 과정은 다음과 같이 진행되었습니다.

1. 목표 유전자 선택 (CCR5)

HIV는 CCR5라는 유전자가 발현하는 단백질을 통해 인간 면역 세포에 침투합니다. 따라서 허젠쿠이 박사는 CRISPR-Cas9 기술을 이용해 이 CCR5 유전자를 비활성화하여 아이들이 HIV에 감염되지 않도록 하려고 했습니다.

• CCR5 유전자는 면역 세포 표면에 위치한 수용체를 암호화하는데, 특정 변이가 있는 경우 이 수용체가 바이러스를 결합하지 못하게 되어 HIV 감염을 막을 수 있습니다.

2. CRISPR-Cas9 시스템 준비

허젠쿠이 박사는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 가이드 RNA(gRNA)를 설계했습니다. 이 RNA는 CCR5 유전자의 특정 위치를 표적으로 하여 Cas9 단백질이 그 부위로 정확히 이동할 수 있도록 합니다.

• 가이드 RNA는 CCR5 유전자 서열 중 절단할 지점을 지정하고, Cas9 단백질은 그 지점을 잘라냅니다.

3. 배아에 CRISPR 도입

허젠쿠이 박사는 시험관 수정(IVF)을 통해 생성된 배아에 CRISPR-Cas9 시스템을 도입했습니다. 배아가 수정된 후, 이 배아에 CRISPR-Cas9 시스템을 주입하여 CCR5 유전자를 편집하도록 했습니다.

• CRISPR-Cas9 시스템이 배아의 세포 내로 들어가 CCR5 유전자를 찾아서 해당 유전자의 특정 서열을 절단합니다.

4. DNA 절단 및 수선

Cas9 단백질이 CCR5 유전자의 목표 서열을 절단한 후, 세포는 자연적으로 이 DNA 손상을 수선하려고 합니다. 이 과정에서 비상동성 말단 결합(NHEJ)을 통해 DNA가 다시 결합되는데, 이 과정에서 CCR5 유전자가 비활성화되거나 완전히 제거될 수 있습니다.

• 비상동성 말단 결합(NHEJ)은 정확한 수선을 하지 못하고 염기쌍이 삽입되거나 삭제되어 유전자가 기능을 상실할 수 있습니다.

5. 배아의 발달

유전자 편집된 배아는 수정 후 배양되어 세포 분열을 통해 계속 성장합니다. 이 과정에서 편집된 유전자가 모든 세포에 전달됩니다. 이후, 이 배아는 여성의 자궁에 착상되어 임신이 이루어졌습니다.

• 허젠쿠이 박사가 유전자 편집을 통해 생성한 두 쌍둥이 여아는 CCR5 유전자가 비활성화되었고, 이로 인해 이들이 HIV에 감염되지 않을 가능성이 높아졌다고 주장했습니다.

6. 결과

허젠쿠이 박사는 이 아이들이 HIV에 면역을 갖게 되었다고 주장했지만, 이 연구는 과학적, 윤리적 논란을 불러일으켰습니다. 이 연구의 문제점은 다음과 같습니다:

• 불확실한 안전성: 배아 유전자 편집이 모든 세포에서 정확하게 이루어졌는지, 그리고 이로 인해 예상치 못한 부작용이 발생하지 않았는지에 대한 검증이 충분하지 않았습니다.

• 윤리적 문제: 생식 세포에서의 유전자 편집은 이후 세대에도 영향을 미치기 때문에, 윤리적 및 사회적 영향을 충분히 고려하지 않은 채 진행되었습니다.

• 오프타겟 효과: CRISPR-Cas9 기술은 종종 목표한 DNA 서열 외의 다른 서열을 잘라 예상치 못한 돌연변이를 유발할 수 있는데, 이로 인한 부작용이나 결과는 충분히 검토되지 않았습니다.

결론

허젠쿠이 박사의 연구는 기술적으로는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 CCR5 유전자를 비활성화시킴으로써 HIV에 대한 면역을 제공하려는 시도였습니다. 하지만 이 실험은 윤리적 기준을 무시한 것으로 평가받았고, 인류의 유전자를 조작하는 데 있어 과학계와 사회가 아직 충분한 논의와 규제가 필요하다는 사실을 일깨워주었습니다.

AAV(아데노 연관 바이러스, Adeno-Associated Virus)는 유전자 치료와 같은 생명공학 응용에서 널리 사용되는 바이러스 벡터입니다. AAV는 유전 물질을 전달하는 운반체로, 다른 바이러스와 달리 병원성을 가지고 있지 않으며 인간에게 질병을 일으키지 않습니다. 이로 인해 AAV는 유전자 전달 도구로 매우 유용하며, 특히 유전자 치료나 유전자 편집 기술에서 널리 사용되고 있습니다.

AAV 바이러스의 특징

• 병원성이 없음: AAV는 자체적으로 인간에게 질병을 일으키지 않으며, 감염된 세포를 파괴하지 않습니다.
• 유전자 전달 벡터로 사용 가능: AAV는 원하는 유전자를 특정 세포에 안전하게 전달할 수 있어, 유전자 치료와 같은 분야에서 매우 유용합니다.
• 넓은 조직 범위: AAV는 다양한 세포와 조직을 표적으로 삼을 수 있으며, 특히 근육, 간, 신경 세포 등에서 효율적으로 작동합니다.
• 장기 발현: AAV로 전달된 유전자는 장기간 발현될 수 있어, 유전자 치료가 장기적인 효과를 가지는 데 도움을 줍니다.

AAV와 CRISPR-Cas9의 관계

AAV는 CRISPR-Cas9 시스템에서 Cas9 단백질과 가이드 RNA(gRNA)를 세포에 전달하는 역할을 할 수 있습니다. CRISPR-Cas9을 통한 유전자 편집을 하려면 Cas9 단백질과 gRNA가 세포 내로 들어가 목표 DNA를 찾아 편집해야 하는데, AAV는 이러한 유전자 편집 도구들을 세포로 전달하는 운반체로서 매우 유용합니다.

AAV가 CRISPR-Cas9 시스템에서 사용되는 방식:

1. Cas9과 gRNA 유전자 삽입:

   • AAV에 Cas9 유전자와 가이드 RNA 유전자를 삽입합니다. 이 유전자들은 AAV가 세포 안으로 전달된 후 세포 내에서 발현되어 Cas9 단백질과 gRNA를 만들어냅니다.

2. 세포 내 전달:

   • AAV는 Cas9과 gRNA를 포함한 유전 물질을 특정 세포로 운반하여 세포 내로 전달합니다. AAV는 감염성 바이러스이기 때문에 세포막을 통과하여 세포 안으로 들어갈 수 있습니다.

3. Cas9 발현:

   • AAV가 전달한 Cas9 유전자와 gRNA 유전자는 세포 내에서 발현되어 Cas9 단백질과 가이드 RNA가 생성됩니다. 이들이 목표로 하는 DNA 서열을 찾아내어 편집을 수행합니다.

4. 유전자 편집:

   • Cas9 단백질이 gRNA에 의해 안내되어 목표 DNA 서열을 절단하고, 그 후 세포의 수선 메커니즘에 의해 유전자 변형이 일어납니다.

AAV-Cas9의 장점

• 높은 전달 효율: AAV는 유전 물질을 세포에 안전하게 전달하는 능력이 매우 높습니다. 다양한 조직에서 잘 작동하며, 특히 근육, 간, 신경 세포 등에서 매우 효과적입니다.

• 병원성 없음: AAV는 병원성이 없으므로, 유전자 치료 및 편집에서 안전하게 사용할 수 있습니다.

• 장기적 발현: AAV는 세포 내로 전달된 유전자가 장기적으로 발현될 수 있어, 유전자 치료의 지속적인 효과를 기대할 수 있습니다.

AAV와 CRISPR-Cas9 사용의 한계

1. 크기 제한:

   • AAV 벡터에 삽입할 수 있는 유전자의 크기가 약 4.7 kb로 제한되어 있습니다. Cas9 단백질은 상대적으로 큰 단백질이기 때문에, 이를 AAV에 삽입할 때 유전자 크기 제한에 걸릴 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, Cas9의 작은 변형체(예: SaCas9)를 사용하는 경우도 있습니다.

2. 면역 반응:

   • AAV는 자연적으로 인간에게 질병을 일으키지 않지만, AAV에 대한 면역 반응이 일어날 수 있습니다. 즉, AAV가 여러 번 사용될 때 면역 체계가 이를 인식하고 반응할 수 있습니다.

3. 오프타겟 효과:

   • CRISPR-Cas9 시스템 자체의 오프타겟 효과(원하지 않는 부위에서의 DNA 절단)가 여전히 문제가 될 수 있습니다. Cas9 단백질이 목표 DNA 외의 부위를 절단할 수 있는 가능성이 있기 때문에, 이로 인한 부작용을 최소화하기 위한 연구가 계속되고 있습니다.

결론

AAV는 Cas9과 가이드 RNA를 유전자 편집이 필요한 세포에 효율적으로 전달할 수 있는 운반체 역할을 합니다. 이를 통해 CRISPR-Cas9 시스템이 정확한 유전자 편집을 수행할 수 있게 도와주며, 유전자 치료와 같은 생명공학 응용 분야에서 중요한 도구로 사용됩니다.

3.Cas9의 grna는 aav 바이러스 벡터에 안들어가나?

Cas9과 gRNA(guided RNA)는 AAV(Adeno-Associated Virus) 바이러스 벡터에 함께 들어가기에는 어려움이 있습니다. 그 이유는 AAV 벡터의 크기 제한 때문입니다.

AAV 벡터의 크기 제한

AAV 벡터는 한 번에 약 4.7 kb(킬로베이스)의 유전자 크기를 운반할 수 있습니다. 그러나 Cas9 단백질의 유전자 크기는 대략 4.2 kb에서 4.5 kb 정도로, AAV 벡터 용량의 거의 대부분을 차지합니다. 여기에 gRNA를 함께 넣으려면, AAV 벡터에 포함할 수 있는 크기 제한을 초과하게 됩니다.

Cas9과 gRNA의 크기 비교

• SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9): 약 4.2 kb
• gRNA: 약 100 bp(0.1 kb)
• 그러나 AAV 벡터의 최대 용량은 4.7 kb로, Cas9과 gRNA를 동시에 탑재하는 것은 이 제한 용량을 초과하게 됩니다.

해결 방법

Cas9과 gRNA를 AAV 벡터에 함께 넣는 문제를 해결하기 위해 몇 가지 대안이 있습니다:

1. 작은 Cas9 변형체 사용:

   • SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9)과 같은 작은 크기의 Cas9 변형체를 사용하는 방법입니다. SaCas9의 유전자 크기는 약 3.2 kb로, SpCas9보다 작기 때문에 AAV 벡터에 SaCas9과 gRNA를 함께 넣을 수 있습니다. 이 방법은 용량 제한 문제를 해결하는 효과적인 대안입니다.

2. Cas9과 gRNA를 별도의 벡터로 분리:

   • Cas9과 gRNA를 각각 두 개의 AAV 벡터로 나누어 전달하는 방법입니다. 하나의 벡터에 Cas9 유전자를, 다른 벡터에 gRNA를 넣어 두 개의 벡터가 동시에 같은 세포로 전달되게끔 조정합니다. 이 방법을 사용하면 각각의 벡터에 더 많은 공간이 확보되어 Cas9과 gRNA를 효율적으로 전달할 수 있습니다.

3. Cas9의 단백질 형태 전달:

   • Cas9 단백질을 단백질 형태로 제조하여 AAV를 통해 전달하는 것이 아니라, 리포좀이나 나노입자를 통해 Cas9 단백질을 직접 전달하는 방법을 사용할 수 있습니다. 이 경우, gRNA만 AAV 벡터에 탑재하여 전달하는 방식으로 Cas9과 gRNA를 세포 내에 함께 전달할 수 있습니다.

결론

Cas9과 gRNA를 동시에 AAV 벡터에 탑재하기에는 크기 제한 때문에 어려움이 있습니다. 이를 해결하기 위해 작은 Cas9 변형체를 사용하거나, Cas9과 gRNA를 따로 전달하는 방법이 많이 사용됩니다.

박테리아들의 cas9은 모두 같은 단백질 구조를 하고 있는건가?

아니요, 박테리아의 Cas9 단백질들은 모두 같은 구조를 가지고 있지는 않습니다. 다양한 박테리아에서 발견된 Cas9 단백질은 기본적인 기능은 비슷하지만, 크기, 서열, 그리고 특정 DNA 서열 인식 방식에서 차이를 보입니다. 각 박테리아 종에서 Cas9은 해당 종의 면역 시스템에 맞춰진 고유한 구조적 특성과 기능을 가지고 있습니다.

Cas9의 다양성

CRISPR-Cas9 시스템은 여러 박테리아에서 발견되며, 다양한 박테리아 종마다 Cas9 단백질의 크기와 세부 구조는 다릅니다. 예를 들어, 가장 많이 사용되는 SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9)은 크기가 약 4.2 kb이지만, SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9)은 3.2 kb로 더 작습니다.

이러한 차이는 Cas9 단백질의 효율성, 정확성, 그리고 DNA 서열 인식 능력에서 영향을 미칩니다. 일부 Cas9 변형체는 특정한 환경에서 더 잘 작동하거나 특정 DNA 서열을 더 정확하게 인식하는 능력을 가집니다.

주요 Cas9 변형체 예시

1. SpCas9 (Streptococcus pyogenes Cas9):

   • 가장 널리 사용되는 Cas9 변형체.
   • 크기: 약 4.2 kb.
   • 자르는 목표 DNA 서열에 대한 PAM 서열: 5'-NGG-3' (NGG는 목표 서열 바로 뒤에 위치하는 필수 서열).

2. SaCas9 (Staphylococcus aureus Cas9):

   • 크기: 약 3.2 kb.
   • PAM 서열: 5'-NNGRRT-3' (R은 퓨린).
   • SpCas9보다 작기 때문에, AAV 벡터로 전달할 때 유리합니다.

3. NmCas9 (Neisseria meningitidis Cas9):

   • 크기: 약 3.2 kb.
   • PAM 서열: 5'-NNNNGATT-3'.
   • 다른 박테리아에서 유래한 Cas9과 다른 PAM 서열을 인식하는 특성이 있습니다.

4. CjCas9 (Campylobacter jejuni Cas9):

   • 크기: 약 3.0 kb.
   • PAM 서열: 5'-NNNNACAC-3'.
   • 매우 작은 크기를 가져 유전자 전달 시스템에 적합한 변형체 중 하나입니다.

구조적 차이

이들 Cas9 단백질은 모두 같은 핵심 기능(즉, DNA를 절단하는 기능)을 가지고 있지만, 각 Cas9의 구조적 차이는 다음과 같은 요소들에 영향을 미칩니다:

• PAM 서열 인식: Cas9 단백질은 목표 DNA를 자르기 위해 반드시 특정한 PAM 서열을 인식해야 합니다. 이 PAM 서열은 Cas9마다 다르기 때문에, 서로 다른 박테리아 종에서 유래한 Cas9은 서로 다른 PAM 서열을 인식합니다.

• 크기: Cas9의 크기는 박테리아마다 다르며, 더 작은 Cas9 단백질은 유전자 전달 벡터(예: AAV 벡터)에서 더 유리하게 사용될 수 있습니다.

• DNA 결합 및 절단 효율: Cas9의 서열과 구조에 따라, DNA를 자르는 효율성이나 정확성도 다를 수 있습니다. 일부 변형체는 특정 환경에서 더 높은 정확도를 보이기도 합니다.

결론

박테리아마다 다양한 Cas9 단백질이 존재하며, 이들 Cas9은 기능적으로는 비슷하지만, 구조적으로는 다릅니다. 이 차이점은 각 Cas9 단백질의 크기, PAM 서열 인식, 그리고 유전자 편집 도구로서의 특성에 영향을 미칩니다. 과학자들은 이러한 다양한 Cas9 변형체를 이용해 다양한 유전자 편집 목적에 맞는 최적화된 시스템을 개발하고 있습니다.

4.그럼 허젠쿠이는 g-rna를 어떻게 설계했나?

허젠쿠이 박사가 CRISPR-Cas9을 이용해 배아의 CCR5 유전자를 편집할 때, gRNA(guide RNA)를 설계한 과정은 CCR5 유전자의 특정 서열을 목표로 했습니다. CRISPR-Cas9 시스템에서 gRNA는 Cas9 단백질이 특정한 DNA 서열로 정확하게 이동할 수 있도록 하는 중요한 역할을 합니다. 허젠쿠이는 HIV 감염과 관련된 CCR5 유전자를 비활성화하거나 변형하기 위해 이 유전자의 특정 부위를 표적으로 삼는 gRNA를 설계했습니다.

허젠쿠이의 gRNA 설계 과정

1. 목표 유전자 선택 (CCR5):

   • 허젠쿠이는 HIV가 CCR5 유전자에 의해 발현되는 단백질을 이용해 인간의 면역 세포에 침투한다는 사실에 주목했습니다. 따라서 이 유전자를 편집해 HIV에 대한 면역을 갖게 하려는 것이 그의 목표였습니다.
   • CCR5 유전자의 돌연변이 중 CCR5-Δ32라는 변이는 이미 자연적으로 존재하며, 이 변이가 있는 사람은 HIV에 저항성을 가지는 것으로 알려져 있었습니다. 이 변이는 CCR5 유전자의 32개의 염기쌍이 결손된 상태로, 기능성 단백질을 생산하지 못해 HIV가 세포에 침입할 수 없게 만듭니다.

2. gRNA 설계:

   • 허젠쿠이는 CRISPR-Cas9 시스템에서 Cas9 단백질이 정확하게 CCR5 유전자의 특정 부분을 절단할 수 있도록 gRNA를 설계했습니다. 이 과정에서 그는 CRISPR 디자인 소프트웨어를 사용해 CCR5 유전자의 표적 서열을 선택하고, 그 서열에 맞는 gRNA를 만들었습니다.
   • gRNA는 대략 20개의 염기쌍으로 이루어진 짧은 RNA 서열로, Cas9 단백질을 유전자의 특정 부분으로 안내합니다.

3. PAM 서열 확인:

   • PAM(protospacer adjacent motif) 서열은 Cas9이 목표 DNA를 인식하고 절단할 때 필요한 서열입니다. 허젠쿠이는 CCR5 유전자 내에서 Cas9이 인식할 수 있는 PAM 서열(SpCas9의 경우 5'-NGG-3')을 찾아 그 부위에 gRNA가 결합할 수 있도록 설계했습니다.
   • PAM 서열 근처의 표적 DNA 서열에 맞게 gRNA를 설계함으로써, Cas9이 정확한 위치에서 DNA를 절단할 수 있게 됩니다.

4. Off-target 효과 최소화:

   • CRISPR-Cas9 시스템을 사용할 때 중요한 요소 중 하나는 off-target 효과(원하지 않는 부위에서의 DNA 절단)입니다. 허젠쿠이는 이 문제를 최소화하기 위해 gRNA의 서열이 CCR5 유전자에만 특이적으로 결합하도록 설계했습니다.
   • 이를 위해 그는 gRNA가 CCR5 유전자 외의 유전자와 일치하지 않도록 주의하여 gRNA 서열을 디자인했으며, 특정 소프트웨어를 통해 오프타겟 가능성을 최소화했습니다.

5. gRNA의 전달:

   • 설계된 gRNA는 배아 세포에 Cas9 단백질과 함께 주입되었습니다. CRISPR-Cas9 시스템은 이 gRNA를 이용해 CCR5 유전자 서열로 안내되었고, Cas9이 그 부위를 절단하게 됩니다.
   • 허젠쿠이는 이 과정에서 시험관 수정(IVF)으로 생성된 배아에 CRISPR-Cas9 시스템을 도입했습니다. Cas9과 gRNA가 배아의 세포에 들어가서 CCR5 유전자를 편집하게 되었습니다.

결론

허젠쿠이 박사는 gRNA를 설계할 때, HIV 감염과 관련된 CCR5 유전자의 특정 서열을 목표로 삼았으며, PAM 서열과 오프타겟 효과를 고려하여 이를 최적화했습니다. 그 결과, gRNA는 Cas9을 정확한 위치로 안내하여 CCR5 유전자를 비활성화 또는 삭제함으로써 아이들이 HIV에 감염되지 않도록 유도하려고 했습니다.

그러나, 이 실험은 과학적 윤리 및 안전성 문제 때문에 많은 비판을 받았습니다. gRNA가 설계된 대로 작동했는지, 그리고 CRISPR-Cas9 편집의 장기적인 안전성과 효과가 충분히 검토되지 않은 상태에서 실험이 진행되었다는 점에서 논란이 있었습니다.

5. 그럼 이 설계된 g-RNA를 AAV 바이러스에 어떻게 넣은건가?

허젠쿠이 박사가 사용한 CRISPR-Cas9 시스템은 AAV 바이러스를 사용하지 않았습니다. 대신, 허젠쿠이는 배아에 직접 CRISPR-Cas9 시스템을 주입하는 방식을 사용했습니다. 그는 시험관 수정(IVF)을 통해 만들어진 배아에 Cas9 단백질과 gRNA(guide RNA)를 주입하여 CCR5 유전자를 편집했습니다.

허젠쿠이 박사의 경우, Cas9과 gRNA가 AAV와 같은 바이러스 벡터를 통해 전달되지 않았으며, CRISPR-Cas9 시스템이 배아에 직접 주입되었습니다. 이를 통해 CCR5 유전자를 비활성화하거나 삭제하려고 했습니다.

구체적인 전달 방식

허젠쿠이가 사용한 방식은 전기천공(electroporation)이나 미세 주입(microinjection) 등의 기법을 통해 배아 세포에 직접 CRISPR-Cas9 시스템을 도입하는 것이었습니다. 이러한 방법들은 CRISPR 시스템이 배아 세포 내로 직접 주입될 수 있게 합니다. 이 방식에서 AAV나 다른 바이러스 벡터가 사용되지 않았습니다.

AAV의 경우

AAV 바이러스 벡터는 주로 유전자 치료 연구에서 성인 세포나 특정 조직에 유전자 편집 도구를 전달하기 위해 자주 사용됩니다. 특히, AAV는 크기가 작고 비병원성이기 때문에 세포 내로 안전하게 유전자를 전달할 수 있습니다. 그러나 AAV는 크기 제한이 있기 때문에, Cas9과 gRNA를 한꺼번에 전달하는 데는 제약이 있으며, 또한 배아에 직접적으로 사용되는 경우는 드물었습니다.

허젠쿠이 실험에서 AAV가 사용되지 않은 이유

• Cas9과 gRNA를 직접 주입: 허젠쿠이 박사는 AAV 같은 바이러스 벡터 대신 CRISPR-Cas9 시스템을 배아에 직접 주입함으로써 더 빠르게 유전자 편집을 수행했습니다. AAV를 사용하는 방법은 주로 성인 세포나 조직에서 사용되며, 배아 유전자 편집에서는 자주 사용되지 않습니다.
• 크기 제한: AAV 벡터는 크기 제한이 있어, 큰 크기의 Cas9 단백질(SpCas9)을 AAV 벡터에 gRNA와 함께 모두 담는 것은 어렵습니다. 따라서 허젠쿠이는 이러한 벡터를 사용하지 않고, 직접 주입 방법을 택한 것으로 보입니다.

결론

허젠쿠이 박사의 실험에서 AAV 바이러스는 사용되지 않았으며, 대신 CRISPR-Cas9 시스템이 배아에 직접 주입되었습니다. AAV는 주로 성인 세포에서 사용되는 유전자 전달 도구로, 배아 유전자 편집에서는 이러한 직접적인 방법이 더 일반적입니다.

6.cas12 cas13는 Cas9랑 뭐가 다른가?

아래는 Cas9, Cas12, Cas13을 비교한 표입니다:

특징	Cas9	Cas12	Cas13
표적 분자	이중 가닥 DNA (dsDNA)	이중 가닥 DNA (dsDNA)	단일 가닥 RNA (ssRNA)
PAM 서열 필요 여부	필요함 (예: NGG)	필요함 (예: TTTN, 다양한 PAM 서열)	필요 없음
비대칭 절단 여부	비대칭 절단 아님 (대칭적으로 절단)	비대칭 절단 (끈적한 끝 생성 가능)	비대칭 절단 (목표 RNA 절단 후 비특이적 RNA도 절단)
표적 분자의 유형	DNA 서열	DNA 서열	RNA 서열
비특이적 절단 활성	없음	목표 DNA 절단 후 비특이적 DNA 절단	목표 RNA 절단 후 비특이적 RNA 절단
크기	4.2 kb (SpCas9)	3.2~4.7 kb (Cas12a, Cas12b 등)	3.2~4.3 kb (Cas13a, Cas13b 등)
주요 응용	유전자 편집, 질병 치료, 연구	유전자 편집, 진단 도구	RNA 기반 유전자 조절, RNA 바이러스 진단
주요 변형체	SpCas9, SaCas9	Cas12a (Cpf1), Cas12b	Cas13a, Cas13b, Cas13d
응용 분야	유전자 편집, 연구 도구, 치료 도구	유전자 편집, 진단 도구	RNA 바이러스 진단, RNA 기반 유전자 조절
주요 사용 시스템	CRISPR-Cas9 시스템	CRISPR-Cas12 시스템	CRISPR-Cas13 시스템

비교 요점:

1. Cas9은 DNA를 절단하는 데 주로 사용되며, PAM 서열이 필요하고, 대칭적으로 이중 가닥 DNA를 절단합니다. Cas9은 유전자 편집에서 가장 널리 사용되는 도구 중 하나입니다.

2. Cas12는 비대칭적으로 DNA를 절단하며, Cas9과 유사하지만 더 다양한 PAM 서열을 인식할 수 있습니다. Cas12는 또한 목표 서열 절단 후 주변 비특이적 DNA도 절단하는 특성을 가지고 있어, 진단 도구로도 많이 사용됩니다.

3. Cas13은 RNA를 목표로 하며, DNA가 아닌 RNA 절단에 특화되어 있습니다. Cas13은 PAM 서열이 필요 없으며, 특정 RNA를 절단한 후 주변의 비특이적 RNA도 절단하는 특성을 가지고 있어, 특히 RNA 바이러스 감지 및 RNA 기반 유전자 조절에 유용합니다.