DNA virus는 크게는 ssDNA virus (Baltimore class II)와 dsDNA virus (Baltimore class I, VII)로 나뉜다. 사실 사람을 감염시키는 ssDNA 바이러스는 Parvovirus 밖에 없다. 이번 강의에서 등장하는 DNA 바이러스는 모두 dsDNA virus이다. 이 dsDNA virus는 그 genome의 size에 따라 다시 세 가지로 나눌 수 있다.

가장 작은 genome을 가진 polyomavirus(SV40), papillomavirus(HPV). 오늘 수업 내용에 등장한다. -ma로 끝나는 애들은 대체로 암을 유발하는 바이러스로써 처음 발견된 경우가 많다. 얘들도 그렇다는 뜻. 참고로 papillomavirus는 사람에게 암 혹은 용종(혹; 사마귀)를 일으키지만, polyomavirus는 쥐에게만 cancer를 일으킨다.

중간 사이즈 바이러스는 adenovirus.

빅사이즈 바이러스는 herpesvirus가 있다.

Characteristics of DNA viruses

1. 작은 genome을 가진 virus들, 이를테면 오늘 등장하는 SV40와 HPV는 host DNA polymerase를 사용하지만, 큰 genome을 가진 adenovirus나 herpes virus는 자기 자신의 viral DNA polymerase를 encoding해서 다닌다. 또 작은 genome 바이러스는 주로 circular한 genome form을 가지고, 큰 genome을 가진 놈들은 대체로 linear한 genome을 갖는다. 둘다 암을 발생시키는 건 똑같다.
2. DNA virus들은 핵 안에서 replication한다.
3. 크게는 early phase, late phase 두가지로 viral life cycle을 구분할 수 있다. early phase에는 genome replication 및 replication에 필요한 gene들이 transcription되고, late phase에는 encapsidation등에 필요한 structural gene이 transcription된다.
4. tumor를 만든다. DNA virus는 유독, cell cycle에 맞추어 replication할 수 밖에 없는데, 이는 host cell의 replicational machinary를 이용하기 때문에 그렇다. 이 말인 즉슨 host cell이 replication할 때만 virus replication도 일어날 수 있고, virus는 자기 자신의 replication을 위해 cell의 성질을 바꾸어 항상 replication할 수 있는 상태로 만든다. 이 과정이 natural 한 건 아니기 때문에, cell은 강제로 replication이 많이 발생하는 상황이 오면 여러 장치들을 통해 브레이크를 거는데, virus가 이 브레이크 마저도 고장낸다. 이렇게 브레이크가 고장난 cell은 replication 기계가 되어버리고, 암세포로 발전하는 것.

바이러스가 암을 일으키는 상황을 좀 더 설명하기 위해서는 cell의 cycle에 대한 설명이 필요하다.
cell은 분화된 이후에 G1 phase를 통해 replication machinary 및 여타 cell survival에 필요한 protein들을 생산하고, cell condition을 정상화한다. 이후 S phase에 진입해 DNA replication을 통해 DNA를 두배로 준비해두고, G2 phase를 통해 mitosis를 준비하게 된다. G2 phase에서 준비가 완료되었다는 que가 떨어지면 mitosis로 진입해 세포분열을 진행하게 된다. 여기서 바이러스가 눈독 들이고 있는 지점이 S phase이다. 이 부분을 자세히 알기 위해서는 관련된 pathway가 설명이 되어야 한다.

평소에는 세포가 준비가 안된 상황에서 혹은 주변 조직이 원하지 않는 level의 replication이 일어나면 안되기 때문에 Cyclin이라는 protein이 phase precedure를 막고 있다. Cyclin D가 Rb protein과 E2F를 binding시키고 이 complex가 HDAC와 complex를 이루어 S phase specific gene의 transcription을 막고 있는데, viral protein은 이 Rb와 binding해서 Rb-E2F binding을 막아버린다. 이렇게 되면 S phase specific gene transcription을 막을 수단이 사라지고, cell은 S phase로 procedure되는 것. 이렇게 과하게 cell의 상태를 modification해버리면 p53이 변화를 인지해서 주변에 피해가 가지 않게 (혹은 위험 sign으로) cell을 apoptosis시켜버리는데, virus는 한술 더 떠서 얘까지 막아버린다. 이러니깐 cell이 해까닥 해서 cancer로 변해 버리는 것. 신기하게도 암을 일으키는 바이러스들은 일관되게 Rb와 p53을 interfere하는 protein을 encoding하고 있는데, 이게 단일 조상으로부터 유래되어 그런 것이 아니라 하나의 목표, 즉 S phase를 향한 방향성, 자연 선택의 압박이 서로 다른 방식으로 같은 기능을 하게 만들었는데 이를 "Convergent evolution" 이라고 한다.

Polyomaviruses : SV40

Genomic structure

Virion structure

• icosahedral, T=7, VP1 as a major capsid subunit (𝛽-berral jelly roll, NLS), VP2/VP3가 VP1 아래에 존재하며 VP2는 Myristated 되어 있어 membrane escape 시 사용됨
• 특이하게 DNA가 histone에 의해 packaging되어 있음

Genome structure

• 하나의 자체 Ori를 중심으로 T(tumor)-antigen을 형성하는 Early region과 VP1~3을 생산하는 Late Region으로 구성되어 있다. T-antigen은 large T-antigene과 small T-antigene 두가지 종류가 있는데, Large T-antigen에는 별에별 기능이 다 있다.

Life cycle

• GM1 ganglioside를 viral receptor로 해서 cell로 receptor mediated endosome internalized되며, Myristated 된 VP2가 membrane을 열고 viral escape를 한다. 이후에 VP1에 포함된 NLS를 통해 importin 𝛼 mediated nucleus internalize된 후에, T-antigen을 생산하면서 early phase에 진입한다. 이 T-antigen이 viral genome replication에 필요한 기능(Pol recruit)을 다 가지고 있어서 T-antigen을 매개로 structural protein들이 생산되고, 핵 안에서 다 assembly된 이후에 cell 밖으로 release된다. T-antigen이 이 virus의 early to late phase transition에 key regulator라고 할 수 있다.

Early to Late, Phase transition

polyomavirus의 phase transition은 viral ori의 어디에 T-Ag이 binding하냐에 따라 결정된다.
polyomavirus의 ori는 late gene-Enhancer-Sp1 binding site-TATA-early gene으로 이루어져 있는데, T-Ag가 early gene 위치에 붙으면 replication이 stop되는거고, TATA에 붙으면 early gene expression, sp1 binding site에 붙으면 late gene이 expression된다.

Large T - antigen

앞서 설명한 것처럼, Large T - antigen는 바이러스 replication에서 거의 모든 기능을 수행한다. 그것도 별다른 spicing이나 modification 없이 단백질 그 자체로.
이 단백질은

> J-LXCXE-NLS-DBD-Helicase-HR

의 구조로 이루어져 있는데, 각각 domain에 다 역할이 있다.

J: Hsp70과 binding해서 confomational change를 일으킴
LXCXE: Rb와 binding해서 cell cycle to S phase procedure
NLS: nucleus localizational signal, 처음으로 발견된 NLS
DBD: Ori와 binding하는 domain, 동시에 Pol𝛼를 recruiting해서 genome replication에서 key role
Helicase: ssDNA와 binding 해서 Pol complex 전체를 recruiting함 → DNA replication initiation : DNA replication 연구에 기여함
	p53, TOP1과도 binding하는 부분. cell apoptosis를 막고 DNA replication을 촉진

이거 이외에, 바이러스는 한번 S phase에 들어간 cell cycle이 G2 phase로 procedure되는 것을 막기 위해 DDR signaling에도 관여한다. DDR signaling은 DNA damage response인데, DDR signaling에 의해 S → M phase로 가게 하는 Cdc25가 degradation되고, 더 이상 cycling을 진전시키지 않고 S phase에서 cycle을 멈춘다. 이 과정에서 ATM이 관여하는데, T-ag는 이 ATM을 활성화시켜 signaling을 유도한다. 이러한 ATM signaling은 정상 세포에서는 Double strand break detection에 의해 유도된다. SV40뿐 아니라 HPV도 같은 이유로 E7을 매개로 ATM signaling을 induce하고, Adenovirus와 HSV-1은 자기 DNA (dsDNA → ssDNA)의 repair를 통한 silencing을 회피하기 위해 DDR을 억제한다.

Effects on host

SV40은 사람세포나 원숭이 세포에서는 cell lysis를 통한 release를 하기 때문에 일단 infection이 되면 살아남는 cell이 없어 cancer가 형성이 안된다. 그러나 mouse cell의 경우는 cell lysis 대신 LT-Ag에 의한 cancer 형성이 이루어진다. 이러한 LT-Ag의 host cell modification to cancer cell ability는 때로 실험을 위해 immotalized cell을 만들 때 많이 사용된다.

재밌는 부분은...p53도 이 바이러스 연구하다가 IP로 T-ag 관련 protein 땡기다가 발견되었다.

Papillomaviruses

circular, dsDNA, small, non-enveloped, icosahedral virus. 대부분의 papillomavirus 아종들은 lesion/wart (or benign tumor) 정도의 증상만 유발하지만, HPV는 암을 유발할 수 있다. 자궁경부암을 유발하는 바이러스(HPV-16, 18)이자, 가다실로 vaccination 되어 "예방할 수 있는 암"이라는 타이틀을 만들어낸 바이러스.

말 나온 김에 가다실(Gardasil)에 대해 짚고 넘어가자면, 총 4가지 virus serotype, HPV-16, 18, 6, 11에 대응할 수 있는 백신이며, VLP(virus-like particle)을 encoding하는 위 4종의 바이러스 L1 protein을 이용해 adaptive immunity를 일으킨다.

바이러스의 특징적인 부분은 아무래도,,,암을 유발한다는 것, 그 때문에 SV40와 마찬가지로 p53과 Rb와 interaction할 수 있는 protein이 encoding되어 있다는 것. DNA가 histone에 의해 packaging되어 있다는 것. 이렇게 histone-packaging된 viral genome을 "minichromosome"이라고 부르기도 한다. SV40처럼 early phase와 late phase로 나뉘어서 replication하는데, 이놈은 특이하게도 세포의 "분화"에 replicational rate가 영향을 받는다. 하나 더, 얘는 아직까지(Apr 20, 2023 기준) cell system에서 cultivation이 안된다.

Sturcture

Virion Structure

capsid protein L1으로 이루어져 있고, DNA는 histone으로 packaging되어 있다. L1 pentamer 안쪽에 L2가 1 pentamer 당 1개씩 들어가 있다.

Genomic structure

promoter가 두개다. Early gene을 위한 것, Late gene을 위한 것. 신기한 것은 둘 다 orf를 공유한다. 즉 같은 reading frame안에서 서로 다른 두 mRNA가 나온다는 뜻. 다만 이 원리가 조금 낯선데, Early gene과 Late gene이 맞닿아 있는 곳에 U-rich element (AAUAA) sequence가 존재한다. 이 부분이,,,잘은 이해가 안되지만 host의 Cleavage stimulatory factor (CstF) level이 낮은 경우 stop codon으로 작용하지 않고 Late pre-mRNA까지 쭉 길게 전사되고, level이 높으면 stop codon으로 작용해 짧은 Early pre-mRNA가 만들어진다.

HPV protein Functions

외워둬야할 부분이라셨다.
HPV는 6개의 Early gene과 2개의 Late gene을 가진다. Late gene은 전부다 capsid protein이다. L1이 major, L2가 minor.
L1은 외부 capsid를 구성하고, L2는 평소에는 숨어있다가 endocytosis되어 외부 pH가 낮아지면 expose되어 endosomal membrane을 lysis하고 virus가 escape하도록 한다.
중요한건 Early protein들이다. 이 중에서도 E1, E2, E6, E7은 하는 역할이 crucial하고 또 특별하다.

E1 protein은 SV40의 LT-Ag처럼 helicase로써 기능한다. origin에 binding해서 DNA replicationdmf initiation한다.
E2는 viral genome ori recognization을 하는 한편, 바이러스의 viral genome을 host chromosome에다가 Brd4 매개로 붙인다. 왜 이 짓을 하는 진 모르겠지만, 암튼 이런 것 때문에 HPV는 host와 replication이 syncronzed되어 있다. 세포가 1회 분열할 때 바이러스 DNA도 한번씩만 복제된다. 여러개의 바이러스가 이런 chromsome에 binding하기 때문에, 어림잡아 50~100 copies 정도가 한번 분열할 때마다 생긴다고 보면된다. 이걸 교수님은 limited replication copy라고 표현하셨던거 같다. 이 바이러스는 stem cell 만을 감염시키는데, 나중에 이 stem cell이 분화될때 copy 수가 1000 fold 정도로 증가한다.

E6 protein은 p53에 binding해서 apoptosis blocking하고, E7 protein은 Rb에 binding해서 cell cycle을 S phase로 밀어붙인다. E7 protein의 Rb binding 원리는 SV40 LT-Ag와 동일하다. Rb를 E2F로부터 뺏어오는 것. 반면에 E6는 좀 특이하다. E6는 p53와 bindign할 때 E6AP와 comples를 이루는데, E6AP는 E3 Ubiquitination ligase이다. p53을 ubiquitination 시켜서 degradation 시킨다는 뜻. 다만 E6AP의 원래 cellular function이 저게 아닌데, E6와 binding함으로써 p53 specificity를 갖게 된다. 이 E3 ligase가 기존에 존재하던 family와는 전혀 다른 종류였기에, HECT(Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus)-type으로 따로 분류되게 된다.
E6와 E7은 그 자체로 cell을 immotalize하기 때문에 암을 일으키는데, 대표적으로 내가 맨날 키우는 HeLa cell이 이 HPV infection으로 인한 cervical cancer cell이다.

Viral life cycle

앞서 말했듯 HPV는 stem cell을 infection 시킨다. 그리고 특이하게, 이 stem cell이 최종분화 되기 전까진 late gene, 그러니까 structural protein을 생산하지 않는다. 다만 천천히 genome의 copy수를 증가시키다가, 최종분화 cell, Squamous epithelia에 이르면 assembly가 일어나고 release된다. 당연히 DNA replication을 위해 처음 들어오자마자 핵 안으로 들어가고, 거기서 E1, E2부터 생산한다(Episomal replication). 이 두 protein이 바이러스 replication을 initiation하고 host chromosome에 viral gene을 conjugation 시키고, 나중에 이르러서야 나머지 gene들, Late gene들을 만들고(Vegetative replication) assembly된다. viral gene의 chromosome conjugation은 viral genome이 dauther cell로 균일하게 이동하게 하는 수단이기도 하다.