크리스퍼 유전자가위 기초-용어 정리

연구실 동기가 정리해준 내용인데 이걸 하나하나 알아보겠습니다.
알맹이는 없는거 같은데 이친구나 저나 학사때 제어랑 인공지능만 공부만 애라서 아직 핵심 보는 눈은 없는 것 같습니다. 우선 논문을 읽으면서 나온 기초 단어들만 정리했습니다.
논문 링크
이쪽 지식이 전무하니 하나도 못 알아보겠습니다. 일단 이쪽 단어들을 분해해서 봐보겠습니다.

Cas9

• Cas9은 특정 DNA 서열을 인식하고 절단하는 단백질입니다. CRISPR 시스템의 중요한 부분으로, 특정 DNA 서열을 자를 수 있는 '유전자 가위' 역할을 합니다. 이 단백질은 원래 박테리아가 바이러스의 DNA를 자르고 무력화하기 위해 사용하는 방어 메커니즘에서 발견되었습니다.
• 크기와 문제점: Cas9 단백질은 1368개의 아미노산으로 이루어져 있어 매우 큽니다. 이 큰 크기 때문에 유전자 치료에 사용할 때 AAV(아데노부속 바이러스)와 같은 전달체에 넣기 어렵습니다. AAV는 작은 바이러스 벡터로, 유전자나 단백질을 체내에 전달하는 역할을 합니다. 하지만 그 크기 제한(약 4.7kb) 때문에 큰 Cas9 단백질을 완전히 담을 수 없습니다.

nCas9 (Nickase Cas9)

• nCas9 (Nickase Cas9)는 유전자 정보의 한 가닥을 절단할 수 있는 기능을 가진 변형된 형태의 Cas9 단백질입니다. 일반적인 Cas9은 두 개의 도메인(HNH 도메인과 RuvC 도메인)을 사용하여 DNA의 이중 가닥을 모두 절단하는 반면, nCas9은 한 가닥만 절단하는 특수한 형태로 변형된 Cas9입니다.

nCas9의 작동 원리:

• 변형된 도메인: nCas9은 Cas9 단백질의 두 개 도메인 중 하나를 비활성화시켜, DNA의 한 가닥만 절단하도록 설계되었습니다. 예를 들어, HNH 도메인을 비활성화하면 RuvC 도메인만 작동하여 한 가닥만 절단할 수 있습니다.
• 이중 절단 방지: 이 변형은 유전자 편집 시 더욱 정교하고 안전한 절단을 가능하게 합니다. 예를 들어, 특정 유전자 서열을 바꾸거나 삽입할 때, 이중 가닥이 아닌 단일 가닥만 절단하여 변이를 유도할 수 있습니다.

왜 nCas9을 사용하나요?

• 안전성: 이중 가닥 절단은 세포에 스트레스를 주거나 의도치 않은 돌연변이를 유발할 수 있습니다. nCas9은 한 가닥만 절단함으로써 이러한 위험을 줄일 수 있습니다.
• 정확한 편집: 단일 가닥 절단을 통해 특정 위치에 정확하게 유전자 삽입이나 교정을 수행할 수 있습니다.

따라서, nCas9은 유전자 정보의 한 가닥을 절단할 수 있는 기능을 가진다는 점에서, 니크아제(nickase)로서의 역할을 수행할 수 있습니다. 이는 유전자 편집 과정에서 더 높은 정밀성과 안전성을 제공하는데 유용합니다.

Cas12f

• Cas12f는 Cas9과 유사한 역할을 하지만, 크기가 훨씬 작은 CRISPR 유전자 가위 시스템입니다. Cas12f는 더 작은 크기(아미노산 수가 적음)로 인해 AAV와 같은 전달체에 쉽게 담을 수 있으며, 이로 인해 유전자 치료에 더 적합할 수 있습니다. Cas12f는 최신 유전자 편집 기술 중 하나로, Cas9의 대안으로 연구되고 있습니다.

TnpB

• TnpB는 Cas 단백질의 진화적 조상으로 생각되는 단백질입니다. 원래는 트랜스포손이라는 DNA 요소와 관련이 있으며, 이 요소들은 유전체 내에서 위치를 이동할 수 있는 특징을 가지고 있습니다. TnpB는 Cas9보다 작고 단순하지만, 유전자 편집을 위한 효소로서의 잠재력을 가지고 있어 연구가 진행되고 있습니다.

HNH 도메인

• HNH 도메인은 Cas9 단백질 내부에 있는 특정한 구조(도메인)로, 이 도메인은 DNA를 자르는 데 중요한 역할을 합니다. HNH 도메인은 Cas9이 목표 DNA 서열을 인식하고 자를 때 필요한 활성 부위 중 하나입니다. 만약 HNH 도메인이 없거나 변형된다면, Cas9은 DNA를 제대로 자를 수 없게 됩니다. 설명이 이해가 어려우니 조금 더 자세히 파고 들어가봐봅시다.

HNH 도메인이란 무엇인가요?

CRISPR-Cas9 시스템을 이해하기 위해서는 Cas9 단백질의 구조와 기능을 알아야 합니다. Cas9은 여러 개의 도메인(구조적 단위)으로 구성되어 있으며, 그 중 HNH 도메인은 매우 중요한 역할을 합니다.

HNH 도메인의 역할**

• HNH 도메인은 Cas9 단백질 내에 있는 촉매 도메인 중 하나입니다. 촉매 도메인은 화학 반응을 촉진하는 역할을 하는 단백질의 부분을 말합니다.

• 기능: HNH 도메인은 목표 DNA의 하나의 가닥을 절단하는 역할을 합니다. Cas9 단백질은 두 개의 촉매 도메인(HNH와 RuvC)을 가지고 있는데, HNH는 하나의 DNA 가닥을, RuvC는 다른 가닥을 절단합니다. 이 두 도메인이 함께 작동하여 DNA의 이중 가닥을 자르는 것입니다.

  

  Cas9 단백질의 구조. HNH 도메인은 녹색으로 표시된 부분입니다.

HNH 도메인은 유전자 정보를 저장하는 장소인가요?**

아니요, HNH 도메인은 유전자 정보를 저장하는 장소가 아닙니다. 대신, HNH 도메인은 DNA를 실제로 절단하는 기능적 부분입니다. 유전자 정보를 저장하고 인식하는 역할은 다른 구성 요소가 담당합니다.

CRISPR-Cas9 시스템의 구성 요소와 역할

1. CRISPR 배열 (CRISPR Array)

   • 역할: 박테리아가 이전에 감염된 바이러스(파지)의 DNA 조각을 저장하는 장소입니다. 이 저장된 정보는 박테리아가 다시 동일한 바이러스에 감염되었을 때 신속하게 대응할 수 있도록 도와줍니다.
   • 구성: 반복 서열과 스페이서(spacer) 서열로 이루어져 있습니다. 스페이서는 이전에 감염된 바이러스의 DNA 조각입니다.

2. gRNA (guide RNA)

   • 역할: CRISPR 배열에서 저장된 스페이서 정보를 기반으로 만들어진 RNA 분자입니다. gRNA는 Cas9 단백질과 결합하여 특정 DNA 서열을 인식하게 합니다.
   • 구성: 두 부분으로 나뉩니다.
     • 스패이서 (Spacer): 목표 DNA 서열과 상보적인 서열을 가지고 있어, Cas9이 정확히 그 위치를 찾도록 안내합니다.
     • 트레이서 (TracrRNA): Cas9과 결합하는 역할을 합니다.

3. Cas9 단백질

   • 역할: gRNA에 의해 안내된 특정 DNA 서열을 인식하고 절단합니다.
   • 구성: 여러 도메인으로 이루어져 있으며, 그 중 HNH 도메인이 DNA 절단을 담당합니다.

비유를 통한 이해

비유: CRISPR-Cas9 시스템을 정밀 공구 키트로 생각해봅시다.

• CRISPR 배열: 키트에 포함된 지도입니다. 이 지도는 어디를 잘라야 하는지에 대한 정보를 저장하고 있습니다.
• gRNA: 지도에서 특정 위치를 지목하는 핀입니다. 이 핀이 정확히 자르고자 하는 위치를 표시합니다.
• Cas9 단백질: 정밀 절단기입니다. 이 절단기는 지목된 위치를 따라 정확하게 자릅니다.
  • HNH 도메인: 절단기의 날카로운 칼날입니다. 이 칼날이 실제로 DNA를 자르는 역할을 합니다.
  • RuvC 도메인: 또 다른 칼날로, DNA의 다른 가닥을 절단합니다.

자 그럼 이제 의문이 듭니다. cas9 단백질은 절단기이고 hnh 도메인이랑 ruvC 도메인은 칼날이라고 설명합니다, 그럼 cas9 단백질만 있다면 절단을 할 수 없는거고 hnh 도메인과 ruvC 도메인이 필수적이다. 이런 뜻일까요? 근데 칼날이 왜 두개나 필요할까요? ruvC나 HNH 하나만 있으면 되는거 아닐까요?

우선 CRISPR-Cas9 시스템에서 Cas9 단백질은 절단기 역할을 하며, HNH 도메인과 RuvC 도메인은 그 절단기의 칼날로서, DNA를 자르는 데 필수적인 부분입니다. 그러나 왜 두 개의 칼날(도메인)이 필요한지를 더 명확하게 이해하기 위해, 이 도메인들이 각기 어떻게 작동하는지를 살펴보겠습니다.

1. Cas9 단백질이 절단기를 대체하는 방식

• Cas9 단백질 자체는 DNA 절단을 실행하는 기계 역할을 합니다. 이 기계는 목표 위치에 정확히 도달할 수 있도록 gRNA의 지도를 따릅니다. 그러나 Cas9 단백질 자체만으로는 절단을 수행할 수 없습니다. 실제 절단 작업은 HNH와 RuvC 도메인이 수행합니다.

2. HNH 도메인과 RuvC 도메인의 역할

• HNH 도메인: Cas9 단백질의 한 부분으로, 이 도메인은 DNA의 한 가닥을 절단합니다. HNH 도메인은 gRNA가 인식한 특정 위치에 있는 DNA 가닥을 절단하는 기능을 담당합니다.

• RuvC 도메인: Cas9 단백질의 또 다른 부분으로, 이 도메인은 DNA의 다른 가닥을 절단합니다. 이 도메인은 HNH 도메인이 절단하지 않은 나머지 DNA 가닥을 절단합니다.

왜 두 개의 칼날이 필요한가?

• 이중 가닥 절단: DNA는 이중 나선 구조로 되어 있습니다. 이중 나선 구조는 두 가닥의 DNA가 서로 꼬여 있는 형태입니다. Cas9 단백질이 목표 DNA를 완전히 자르려면 두 가닥을 모두 절단해야 합니다. HNH 도메인과 RuvC 도메인은 각자 하나의 가닥을 절단하여, 두 가닥 모두가 절단되도록 보장합니다. 만약 하나의 도메인만 작동한다면, DNA의 한 가닥만 절단되고, 완전한 절단이 이루어지지 않으므로 유전자 편집이 제대로 되지 않습니다.

요약

• Cas9 단백질은 gRNA에 의해 인도되어 목표 위치에 도달합니다.
• HNH 도메인과 RuvC 도메인은 각각 DNA의 한 가닥을 절단하여, 두 가닥 모두가 절단되도록 합니다.
• 두 도메인이 모두 작동해야 DNA 이중 나선이 완전히 절단되고, CRISPR-Cas9 시스템이 효과적으로 유전자 편집을 수행할 수 있습니다.

따라서 Cas9 단백질이 DNA 절단을 수행하기 위해서는 HNH와 RuvC 도메인이 모두 필요합니다. 이 두 도메인이 함께 작동함으로써, DNA를 정확하고 완전히 절단할 수 있는 것입니다.

조금 더 간단하게 요약하면 다음과 같이 설명할 수 있을 것 같습니다.

• HNH 도메인은 Cas9 단백질 내에서 목표 DNA를 절단하는 역할을 하는 부분입니다.
• 유전자 정보의 저장과 인식은 CRISPR 배열과 gRNA가 담당합니다.
• HNH 도메인은 절단 도구로서, 저장된 정보와 협력하여 정확한 유전자 편집을 가능하게 합니다.

이해를 돕기 위해 비유를 사용했지만, 실제로는 HNH 도메인이 DNA 절단을 담당하고, 유전자 정보는 CRISPR 배열과 gRNA가 관리한다는 점을 기억하시면 됩니다. CRISPR-Cas9 시스템 전체가 협력하여 박테리아가 바이러스에 맞서 싸우는 중요한 방어 메커니즘으로 작동합니다.

니크아제 (Nickase)

• 니크아제는 DNA 이중 나선 중 한 가닥만 절단하는 효소를 의미합니다. 일반적인 제한효소나 Cas9은 DNA 이중 나선의 두 가닥을 모두 절단하지만, 니크아제는 한 가닥만 절단하여 유전자 편집 과정에서 더 세밀한 조작을 가능하게 합니다. 이를 통해 유전자 변형이나 편집을 보다 정교하게 할 수 있습니다.

AAV

AAV (Adeno-Associated Virus)는 유전자 치료에서 흔히 사용되는 바이러스 벡터입니다. 벡터는 유전물질을 다른 세포로 전달하는 데 사용되는 운반체라고 생각하면 됩니다. AAV는 인간에게 질병을 일으키지 않으면서도 유전자를 효율적으로 전달할 수 있기 때문에 유전자 치료 연구에서 많이 사용됩니다.

AAV의 특징과 제한

1. 작은 크기: AAV는 매우 작아서 세포에 유전물질을 전달하는 데 효과적입니다. 그러나 이 작은 크기 때문에 유전물질을 담을 수 있는 공간이 제한적입니다. AAV의 패키징 용량은 약 4.7kb(킬로베이스) 정도로, 이는 4700개의 염기쌍에 해당합니다. 따라서 AAV는 이보다 더 큰 유전물질을 담을 수 없습니다.

2. 유전물질 크기의 제한: Cas9 단백질은 약 1368개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 이와 결합하는 gRNA 등 추가적인 요소들도 포함해야 합니다. Cas9 단백질의 유전자 코드는 약 4.2kb 정도의 크기를 차지합니다. 그러나 Cas9과 gRNA, 프로모터 등 모든 필요한 구성 요소들을 함께 패키징하려면 4.7kb 이상의 공간이 필요합니다. AAV의 용량은 이보다 작기 때문에 Cas9 유전자 전체를 담기에는 불충분합니다.

왜 다른 벡터를 사용하지 않나요?

AAV는 작은 크기 외에도 다음과 같은 장점이 있어 여전히 많이 사용됩니다:

• 안전성: AAV는 사람에게 병을 일으키지 않으며, 면역 반응도 적어 비교적 안전하게 사용할 수 있습니다.
• 지속적인 발현: AAV는 세포 내에서 오랫동안 유전자를 발현시킬 수 있어, 유전자 치료에 효과적입니다.

하지만 Cas9처럼 큰 유전자를 운반할 때는 AAV 대신 렌티바이러스(Lentivirus)나 아데노바이러스(Adenovirus) 같은 다른 벡터를 사용하거나, Cas9을 작은 버전으로 변형하는 등의 방법이 필요합니다. 정리하자면

• AAV는 유전자 치료에서 안전하고 효율적으로 유전자를 전달하는데 적합한 작은 바이러스 벡터입니다.
• 하지만 AAV의 크기 제한으로 인해, Cas9 단백질 전체와 그에 필요한 구성 요소들을 함께 담기에는 공간이 부족합니다.
• 따라서 Cas9의 작은 변형체를 만들거나 다른 벡터를 사용하여 유전자 편집을 시도하게 됩니다.

기본용어 정리

• Cas9은 강력한 유전자 가위이지만, 그 크기 때문에 전달에 제한이 있습니다.
• nCas9은 한 가닥만 자르는 니크아제로 변형된 Cas9입니다.
• Cas12f와 TnpB는 더 작은 대체 유전자 가위로 연구되고 있습니다.
• HNH 도메인은 Cas9이 DNA를 자르는 데 필수적인 구조입니다.
• 니크아제는 DNA를 더 세밀하게 편집하기 위한 효소입니다.
• AAV는 유전자 치료에서 흔히 사용되는 바이러스 벡터입니다. 벡터는 유전물질을 다른 세포로 전달하는 데 사용되는 운반체입니다.

논문 내용

Cas9는 크기가 너무 커서(1368개의 아미노산), nCas9을 기반으로 한 염기 편집기는 단일 AAV로 포장하여 전달하기 어렵습니다(한계는 4.7kb). 이로 인해 체내 유전자 편집의 개발과 적용이 크게 제한되고 있습니다. 최근 몇 년 동안 일련의 컴팩트한 Cas9 단백질, Cas12f 계열의 동족체, 그리고 그 조상 단백질인 TnpB가 보고되었지만, 편집 활성이 제한적이거나 HNH 도메인이 없어 니크아제로 개조하기 어려워 염기 편집기의 개발에 제한이 있었습니다.

2021년, 장펑 연구팀은 IS200/IS605 전이유전자 초과족이 암호화한 IscB 뉴클레아제가 Cas9의 조상 단백질로 간주되며, Cas9과 유사한 HNH 및 RuvC 도메인을 가지고 있으며, 약 500개의 아미노산(SpCas9의 약 1/3 크기)만을 가지면서 미니 염기 편집기로 개발될 가능성을 가지고 있음을 발견했습니다.

2023년, 양후이 연구팀은 OgeuIscB/ωRNA 시스템의 엔지니어링 개조를 통해 고효율의 OgeuIscB 변형체(enOgeuIscB)를 개발하였으며, 탈아미노화효소 도메인과 결합하여 고효율 미니 염기 편집기(miBE)를 개발하였습니다. 이는 DNA 단일 염기 편집 분야를 미니형의 '신시대'로 이끌며, 큰 임상적 적용 가능성을 보여줍니다. 그러나, IscB/ωRNA 시스템은 목표 DNA를 인식하기 위해 엄격한 6개의 염기 타겟 시퀀스 인접 모티프(TAM)를 필요로 하며, 인식할 수 있는 위치가 제한적입니다. 따라서 더 넓은 타겟 인식 범위를 가진 고효율 소형 IscB 염기 편집기를 개발하는 것이 매우 필요합니다.

2024년 8월 15일, 후이다(상하이) 바이오테크놀로지 유한회사 연구팀, 푸단대학 부속 이비인후과 병원 황진하이 연구팀, 그리고 중과원 뇌과학 및 지능 기술 혁신 센터 양후이 연구팀은 Nature Chemical Biology 저널에 "확장된 타겟 범위를 가진 개량된 IscB–ωRNA 시스템"이라는 제목의 논문을 발표하였습니다.

이 연구에서는 메타게놈 데이터를 활용하여 다양한 타겟 시퀀스 인접 모티프(TAM) 범위를 가진 19종의 새로운 IscB-ωRNA 시스템을 식별했습니다. RNA 구조 최적화, 단백질 공학적 개조, 유세포 분석, 오프타겟 검출 등의 기술을 종합적으로 사용하여 인간 세포 내에서 더 넓은 타겟 인식 범위와 더 높은 편집 활성을 가진 IscB 시스템(IscB.m16*)을 성공적으로 개발했습니다. 이를 바탕으로 탈아미노화효소 도메인과 결합하여 새로운 IscB 기반의 미니형 아데닌 및 사이토신 염기 편집기를 추가로 개발하였으며, 이 편집기는 포유류 세포와 질병 모델 쥐에서, SpCas9-BE가 비활성화된 질병 부위에서도 강력한 염기 편집 효율과 광범위한 타겟 인식 능력을 검증하여 향후 정밀 유전자 치료의 임상 적용에 강력한 지원을 제공합니다.