[논문 리뷰] AF2χ Predicting protein side-chain rotamer distributions with AlphaFold2

💡 Abstract

✅ 문제의식

단백질 Sidechain의 유연성은 구성(conformation) 엔트로피의 핵심이며, 폴딩·안정성·분자 상호작용 같은 과정에 영향을 줌

기존 실험·예측 도구(AlphaFold)는 용액에서의 Sidechain 이질성을 체계적으로 다루기 어려움
특히, sidechain 배치의 앙상블(ensemble, sidechain 존재 경우의 수 집단)이 아니라 단일 최저에너지 상태 복원에 집중

✅ 해결책: AF2χ

AF2 내부 표현을 이용해 잔기별 χ-각 분포를 추정
→ 그 분포를 샘플링해 현실적인 sidechain 앙상블 생성

NMR 3J 결합, S²(질서 매개변수) 같은 실험 지표, 그리고 실험 구조 모음에서 유도한 이면각(χ) 분포를 사용해 AF2χ를 광범위하게 벤치마크하여, 정확한 sidechain 앙상블을 생성하는 데 있어 AF2χ의 정확성을 입증

✅ 비교 성능

MD 및 최신 ML 앙상블 모델 대비 동급 혹은 최첨단 정확도
MD보다 훨씬 빠름(orders of magnitude)

💡 Introduction

단백질 사이드체인의 유연성은 구성 엔트로피에 중요하며, 단백질 폴딩, 안정성, 분자 간 상호작용 같은 과정에서 핵심 역할

단백질 내에서도 사이드체인의 유연성은 위치마다 크게 다를 수 있음

어떤 잔기들은 주변 환경의 제약으로 인해 χ 각이 거의 하나의 로타머 상태만을 주로 점유할 만큼 경직되어 있는 반면,
다른 잔기들은 상당한 이질성(heterogeneity)을 보임
이런 이질성은 해당 잔기의 국소 환경(백본 구조, 접촉의 개수 등) 요인에 의해 좌우됨

✅ 문제의식

기존 도구들은 “정답 로타머 하나”를 잘 맞히는 데 최적화되어 있음
그러나 실제 단백질은 자리마다 로타머가 여럿일 수 있고, 그 분포(확률)가 기능·결합·안정성에 중요함

1️⃣ 로타머 라이브러리는 사이드체인의 구성(χ 각 분포)을 예측하는 데 널리 쓰이는 도구
고품질 단백질 구조들에서 관측된 χ-각을 이산 분포로 정리해 놓은 것

다만 로타머 라이브러리는 “이 지점이 용액에서 실제로 어떤 분포를 가지는가”를 직접 나타내도록 설계된 것은 아님
즉, 자주 보이는 유형 분류에는 훌륭하지만, 현실의 앙상블 분포를 그대로 주지는 않음

2️⃣ MD 시뮬레이션은 사이드체인 이질성 연구에 폭넓게 쓰여 왔지만, 계산 비용 때문에 많은 시스템에 쉽게 확장하기 어려움

3️⃣ AlphaFold2(AF2) 같은 구조 예측 도구, DLpacker/H-packer 같은 사이드체인 패킹 도구가 등장

하지만 이들은 입력 백본이 주어졌을 때 주요(dihedral) 상태 하나를 복구하는 데 초점을 맞추며, 사이드체인 이질성을 연구하도록 설계된 것은 아님

✅ 기존 계산 도구의 한계

로타머 라이브러리: “어떤 모양들이 흔한가”는 잘 말해주지만, 특정 자리의 실제 용액 분포는 직접 안 알려줌

AF2/사이드체인 패커: 단일 상태 복원에 초점, 이질성 모델링은 아님

AF2χ(AF2-chi) 는 AF2를 기반으로 각 잔기별 사이드체인 χ-각의 ‘분포’를 예측하고, 그 분포를 바탕으로 다양한 사이드체인 자세를 갖는 구조 앙상블을 생성하는 방법

AF2χ 결과를 폭넓게 비교·검증

1️⃣ HSP 앙상블
2️⃣ NMR S²(질서 매개변수)
3️⃣ NMR 3J 결합
4️⃣ MD 시뮬레이션

✅ AF2χ의 제안

AF2의 정보를 활용해 잔기별 χ-각 ‘분포’를 예측하고, 그 분포를 샘플링해 사이드체인만 다양한 구조 앙상블을 생성

🖐 χ(카이) 각 / 로타머

사이드체인의 결합 회전각(χ1, χ2, …)
이 각들이 모여 대표 자세(로타머)를 이룸
잔기·환경에 따라 하나만 주로 점유하거나 여러 개를 왔다 갔다 할 수 있음

🖐 HSP 앙상블 (High-Sequence-Similarity PDB ensembles)

서열이 거의 같은(보통 90–100% 일치) 여러 PDB 구조를 한데 모아 같은 단백질이 환경만 달라졌을 때 나타나는 구조 변이를 본 모음

잔기별로 χ(카이) 각 분포, 원자 좌표의 분산/RMSF, 다중 점유(altloc) 등을 집계

용액의 평형 요동을 간접적으로 비춰줌
(결정 환경/온도/리간드/돌연변이 차이가 ‘허용되는 구조 폭’을 드러냄)

백본은 비슷한데 사이드체인만 여러 로타머를 오가면
→ 그 자리는 유연/이질성↑로 해석

🖐 평형 요동 (equilibrium fluctuations)

단백질이 평형(안정) 상태 주변에서 열(온도) 때문에 계속 미세하게 흔들리고 변형되는 움직임

X-ray의 B-factor, NMR의 S²(질서 매개변수), MD의 RMSF 같은 값에 반영됨

이 요동의 크기·패턴이 결합 친화도, 안정성, 효소 활성 등에 직결(= 구성 엔트로피와 연결)

🖐 NMR 3J 결합

NMR 은 자기장 떨림으로 원자를 관찰
-> 이때 밑의 뉴만 구조식에 의해, 원자가 많이 겹쳐있으면 많이 떨림
-> 따라서, 이를 θ 차이로 재해석

1️⃣ J 결합: NMR에서 공간을 통하지 않고, 공유결합 전자를 통해 전달되는 상호작용 세기

“공간을 통하지 않고”: NMR에서 신호가 공유결합(전자구름)을 타고 전달된다는 뜻
즉, 두 핵이 서로 가깝게 붙어있지 않아도, 결합으로 연결되어 있으면 신호가 결합 경로를 따라 전해진다는 의미
(거리와는 별개, 공간적으로 멀리 떨어져도 결합으로 이어져 있으면 나타남)

뉴만 구조식
-> 여기서 빨간색과 파란색 사이각이 Karplus 식의 θ

Karplus 식

J 결합의 의존성: 이면각(χ1 등), 결합수, 결합 종류에 따라 값이 달라짐
→ Karplus 관계로 각도 추정

2️⃣ 3J: 세 개의 공유결합을 거친 두 핵 사이의 J 결합 상수

ex)
Hα–Hβ는 경로 Hα–Cα–Cβ–Hβ 로 3개의 결합을 거침
→ ^3J_{Hα,Hβ}

결합 축 주변의 이웃 원자 배치(=이면각 θ)에 민감(특히 χ1)

단백질 사이드체인의 χ1은 여러 3J 조합(Hα–Hβ, HN–Cβ 등)에 반영됨
→ 여러 3J를 함께 보면 χ1 로타머 점유 분율을 역추정 가능

trans(≈180°)일 때 보통 큰 값, gauche(≈±60°)일 때 작은 값이 나오는 정성적 패턴이 매우 강함

실험적으로 얻은 3J 패턴이 gauche↑ vs trans↑를 알려주면
→ 자리별 χ1 분포를 정량화할 수 있음
→ 여러 3J를 함께 보면 어떤 로타머(χ 각)들이 얼마나 점유되는지 앙상블 평균으로 추정 가능

🖐 NMR S²(질서 매개변수)

특정 결합 벡터(메틸 C–C₃축, 백본 N–H 등)의 방향이 시간에 따라 얼마나 흔들리는지(ps–ns 범위)를 0–1로 수치화

• 1에 가까울수록 거의 안 흔들림(경직)
• 0에 가까울수록 많이 흔들림(유연)

ps–ns 범위의 국소 유연성을 숫자로 비교 가능(도메인/부위별 경직도 지도)

• 백본 S²(N–H)는 접힌 영역이면 보통 0.8–0.95, 루프/단말은 낮아짐
• 메틸 S²_axis는 사이드체인 내부 자유도(메틸 주변) 반영
  → 로타머 교환의 여지를 간접 시사

🖐 메틸 S²_axis

메틸기(–CH₃)의 대칭축(보통 C–C 축)이 ps–ns 시간척도에서 얼마나 흔들리는지 0–1로 나타낸 값

사이드체인 내부 유연성 지표
값이 낮을수록 여러 로타머/미세운동 가능성 ↑

🖐 DER

MD로 만든 사전 앙상블을 실험 데이터(NMR 3J/NOE/RDC/SAXS 등)에 최소한의 왜곡(최대 엔트로피/Bayesian 리웨이팅)으로 맞춰 현실적인 용액 앙상블로 다듬는 절차
→ 물리(힘장)와 실험을 동시에 존중하는 앙상블 획득
→ 용액 상태에서의 현실적인 앙상블을 얻는 방법

💡 Results and Discussion

목표는 AF2χ를 통해,
용액 상태에서 단백질 구조의 사이드체인 구조 이질성(다양성)을 빠르고 정확하게 모델링하고,
이를 여러 개의 구조(앙상블)로 표현하는 방법을 개발하는 것

✅ HSP 앙상블의 유효성

서열이 매우 비슷한 PDB 구조들을 모아 정렬하면, 용액에서 실제로 점유되는 사이드체인 로타머 분포를 상당히 그럴듯하게 복원할 수 있음

논문에서는 χ1에 민감한 NMR 3J를 계산해 실험과 높은 상관을 보여줌

단백질의 HSP 앙상블을 만들고, Karplus 방정식으로 실험에 대응하는 3J를 계산
그 결과, 실험 3J와 좋은 상관을 보임 (Table S1)

DER와 대등한 지점:
최소 UBQ에 대해선, HSP로 계산한 3J가 DER(=MD+NMR 정련) 앙상블의 정확도에 필적

데이터 양의 한계:

좋은 상관을 얻으려면 최소 20개 이상의 구조가 필요
이 기준을 만족하는 단백질은 소수 → 보편적 도구로 쓰기엔 제약

결론적으로, 대부분의 단백질은 20개 이상의 실험 구조를 갖고 있지 않기 때문에,
HSP 앙상블은 사이드체인 구조 이질성을 일반적으로 특징짓는 보편적 접근법이 되기는 어려움

AF2χ가 필요한 이유

하지만 대부분의 단백질은 HSP가 빈약(구조가 몇 개 없거나 없음)
AF2χ는 HSP가 부족한 일반적인 경우에도 빠르게 분포와 엔SEMBLE을 제공하므로 현실적 대안/보완재

✅ AF2 구조 모듈의 사이드체인 유닛(8개 레이어) 안에 로타머 분포 단서가 숨겨져 있다

AF2의 ‘안쪽 레이어(inner layers)’는 χ 각의 ‘분포’를 반영하는 평균값에 더 가깝고,
마지막 레이어(last/outer) 는 그 분포를 단일 안정 로타머(정규 staggered 상태) 로 수렴시킴

그래서 용액에서의 로타머 이질성을 알고 싶으면 안쪽 레이어 정보가 더 유용

UBQ(유비퀴틴) 을 테스트로, AF2 구조 모듈 사이드체인 유닛의 8개 레이어에서 χ1, χ2 예측값을 모두 뽑아 비교

처음 7개 레이어(안쪽) 에서는 χ 값이 거의 안 변하는데, 마지막 레이어에서 특정 잔기들의 χ가 크게 이동
안쪽 레이어는 가끔 로타머 사이 같은 중간 각도 내지만, 마지막 레이어는 보통 정규 staggered(±60°, 180°) 로 정리함
-> 모델 내부에선 여러 χ 상태의 혼합 정보가 남아 있다가, 최종 산출 단계에서 하나의 로타머로 collapse 한다는 가설

DER의 평균 χ1(안쪽 원) vs AF2 마지막 레이어(g)
DER의 평균 χ1(안쪽 원) vs 안쪽 레이어(h) χ1(바깥 원) 비교
—> 안쪽 레이어가 더 잘 맞음

다중 로타머를 샘플하는 잔기들만 골라 DER 평균 χ1과
AF2 안쪽(i), 마지막(j) 를 산점도로 비교
-> 안쪽 레이어 상관이 더 높음

모든 잔기 χ1: DER 평균 χ1과의 상관

• 안쪽 레이어: ρ≈0.83
• 마지막 레이어: ρ≈0.69 (그림 1g,h의 원형 상관)

다중-웰(여러 로타머) 잔기 χ1만 보면 차이가 더 커짐

• 안쪽 레이어: ρ≈0.80
• 마지막 레이어: ρ≈0.62

χ2도 같은 경향: 안쪽 ρ≈0.58 vs 마지막 ρ≈0.51. (보조그림 S2)

로타머 분포를 알고 싶다면
AF2의 마지막 구조 값만 보지 말고, 안쪽 레이어 χ를 활용해야 앙상블 평균에 가까움
→ 이후 AF2χ가 이 ‘안쪽 레이어 χ 평균’을 BME 리웨이팅의 타깃으로 쓰는 이유

다중-웰 자리 선별
CDR 등에서 다중 로타머가 의심되는 잔기는 안쪽 레이어–DER 상관↑
→ 앙상블 도킹/리패킹에 특히 중요

마지막 레이어만 쓰면 staggered 한 상태로 과도 수렴
→ 이질성·엔트로피 과소평가 위험

✅ AF2χ를 어떻게 만들었고, 어떻게 튜닝했으며, 그 결과가 어떠했는지

문제: AF2는 마지막에 로타머 하나로 결론을 내리지만, 실제 단백질은 여러 로타머가 섞여 있음

힌트: AF2의 안쪽 레이어가 “이 자리는 평균적으로 이 방향쯤이야”라는 평균 힌트를 줌

목표: 그 평균 힌트에 맞는 ‘확률 분포(=로타머 비율)’를 만들어서 앙상블(여러 구조) 을 뽑아내야함

1️⃣ AF2χ의 발상과 구성

• 핵심 아이디어

AF2 구조모듈의 안쪽 레이어(inner layers) 가 내놓는 χ 각 예측이 앙상블 평균에 더 가깝다는 관찰을 이용해서, 그 평균에 맞는 χ-각 ‘분포’를 역추정
이를 위해 BME(베이지안/최대엔트로피) 리웨이팅을 사용해, 사전(prior) χ-분포를 안쪽 레이어의 평균 χ와 일치하도록 업데이트

🖐 “평균에 맞는 분포를 역추정”이란?

🔎 쉬운 예시
세 가지 맛(로타머) 아이스크림 g-(왼쪽), t(가운데), g+ (오른쪽) 이 있음
가게 매니저(=안쪽 레이어)가 “오늘 손님들이 평균적으로 t 쪽을 좀 더 선호하네”라고 알려줌(= 평균 힌트)

우리는 손님들이 실제로 각 맛을 얼마나 먹는지 비율(분포)을 알아내고 싶음
그래서 기존 추정치(= prior: 대략 g-20%, t 60%, g+20%)에서 가능한 한 적게만 손대서, 평균이 매니저 말과 딱 맞도록 비율을 살짝 조정(예: g-25%, t 50%, g+25%).
→ 이 “가능한 한 적게만 고쳐서 평균을 맞춘다” 방법이 BME 리웨이팅

BME = 기존 분포를 ‘최소 수정’으로 평균(제약)에 맞춰주는 방법

• 그렇다면 무엇을 priors로 쓰나?

AF2 마지막 레이어가 내놓은 χ(즉, 최종 구조의 χ)를 가우시안 중심으로 삼고, Top8000 로타머 라이브러리의 분포와 가중 평균해서 prior χ-분포를 만듦
그다음 안쪽 레이어의 χ를 BME의 목표 평균으로 사용하여 posterior χ-분포를 얻음

🔎 쉬운 예시
AF2 마지막 레이어: “오늘은 t 맛이 제일 인기일 거야!” 하고 강한 한 표 던짐 → t 중심으로 좁은 가정(가우시안)

Top8000 로타머 라이브러리: “보통 가게 전체 데이터를 보면 g-/t/g+가 이렇게들 팔려” 하는 일반 통계

둘을 섞어서 초안 비율(= prior)을 만든 다음,
안쪽 레이어의 평균 힌트에 맞추도록 BME로 살짝 손봐서 최종 비율(= posterior)을 얻는 것

prior = (AF2 마지막의 ‘하나 찍기’ + 로타머 일반 통계)의 섞은 초안,
posterior = 그 초안을 평균 힌트에 맞춰 살짝 조정한 결과.

• 출력

잔기별 χ-각 분포(Posterior) 세트를 얻고, 이를 샘플링(+짧은 릴랙스)해서 사이드체인 앙상블 구조를 만듦
입력은 서열 + 백본 템플릿이며, AF2로 χ1/χ2 정보를 뽑아 씀

입력: 서열 + 템플릿 백본
→ AF2 구조모듈에서 마지막 레이어 χ와 안쪽 레이어 χ를 모두 추출

Prior: “마지막 레이어 χ 중심 가우시안” + “Top8000 분포”의 가중합

BME 리웨이팅: 안쪽 레이어 χ 평균에 맞추어 prior를 조정
→ Posterior(잔기별 χ-분포)

샘플링 → 앙상블: Posterior에서 χ를 뽑아 구조 다발(앙상블) 생성
→ 사이드체인 이질성 재현

🖐 “샘플링(+짧은 릴랙스)”이란?

🔎 쉬운 예시
샘플링: 최종 비율(예: g-25%, t 50%, g+25%)대로 공을 뽑듯이 각 잔기의 로타머를 골라 여러 개 구조를 만든다(= 앙상블)

짧은 릴랙스: 막 옮긴 가구(원자)들이 살짝 부딪힐 수 있으니, 방(힘장) 안에서 자리만 살짝 정리해주는 빠른 정리 단계.
모양은 안 바꾸고 충돌만 없앰

샘플링 = 확률대로 뽑아 여러 구조 만들기
짧은 릴랙스 = 충돌만 빠르게 다듬기

🖐 템플릿 사용 유무

• 언제 “무조건” 템플릿을 쓰는 게 낫나?

실험 구조가 있고 그 구조 주변의 로타머 이질성이 궁금할 때
(예: X-ray/AF-pred 백본 고정한 채 CDR 사이드체인 분포를 보고 싶다)

도킹 포즈/여러 결합 모드를 비교 평가할 때
(각 포즈를 템플릿으로 주고 AF2χ 엔SEMBLE을 만들어 포즈별 일관성/강건성 확인)

상태 의존(apo↔holo, pH, 돌연변이 후) 차이를 백본별로 보고 싶을 때

• 언제 템플릿 없이 가도 되나?

아직 대표 구조 자체가 궁금하고, 특정 상태에 묶일 필요가 없을 때

템플릿 품질/정합이 불확실하거나, 유사 구조가 드문 단백질일 때

2️⃣ 모델 파라미터 튜닝

• AF2 실행 모드 선택

UBQ를 파일럿으로 다양한 세팅을 비교했더니 두 가지가 DER 평균과 가장 잘 맞았음

(i) 기본 AF2(풀 MSA, 템플릿 없음, best-ranked 구조 사용)
(ii) single-sequence + 템플릿(“decoy” 전략), 템플릿을 쓰는 모델 중 best-ranked

두 세팅의 정확도가 비슷해도, 임의의 템플릿 백본 주변을 탐색할 수 있도록 표준 세팅은 (ii)로 채택

• Prior 혼합비(Top8000 : AF2 가우시안)

HSP의 χ-분포와의 JS-divergence(분포 유사도), NMR 3J RMSE를 기준으로 최적 혼합비를 탐색한 결과, Top8000 15% : AF2 85%가 단독 사용보다 유의하게 좋음으로 선정되었음

• 앙상블 크기(구조 개수)

부트스트랩으로 크기를 달리해보니 최소 20개는 되어야 3J를 재현할 수 있었고, 실제 운용은 100개 구조로 생성했음

• 참고(구현 디테일)

LocalColabFold에서 표준 세팅과 decoy 전략(single_sequence + custom template)을 지원하고, 안쪽 레이어(2~7회차) 평균을 BME 타깃으로, 마지막 레이어 값을 prior의 중심으로 씀

3️⃣ 결과 요약(UBQ 기준)

• HSP 분포와의 유사도(JS-div)

AF2χ의 χ1/χ2 분포가 AF2 단일 구조나 Top8000보다 HSP에 더 가깝고, MD(CHARMM36m)·DER와 비슷한 수준
특히 다중-웰(여러 로타머) 잔기에서는 AF2χ가 MD보다 더 잘 맞는 경우도 확인

• NMR 3J와의 일치

UBQ에서 AF2χ의 3J 예측은 MD와 유사한 정확도(종종 DER 계산치에 필적)이며, BME 리웨이팅 단계가 세 가지 3J 타입 모두에서 전반적 일치를 개선
→ 안쪽 레이어 정보가 로타머 분포 정확도를 높여줌

✅ AF2χ가 정말 현실(실험·MD)과 맞나? 어디서 얼마나 좋은가?

1️⃣ NMR J-couplings 검증

1-1. 단백질·지표

대상 단백질: GB3(B3 도메인), HEWL, BPTI (UBQ는 앞에서 이미 검증)

지표: χ1에 민감한 NMR 3J (여러 결합쌍 세트)

1-2. 분포 자체의 타당성

JS-divergence(JS_div): AF2χ가 만든 χ 분포가 HSP 앙상블(실험구조 다중중첩) 분포와 얼마나 가까운지(작을수록 좋음)

NMR 3J: Karplus로 각 구조(혹은 엔SEMBLE)에서 3J를 계산
→ 실험값과 RMSE로 비교(작을수록 좋음)

분포 정확도(UBQ): AF2χ의 χ1/χ2 분포는 HSP와 매우 유사하고, MD/DER와 동급(Top8000·AF2 단일구조보다 우수).

특히 다중-웰(여러 로타머) 잔기에서 이점이 큼.

1-3. 3J 예측 자체의 정확도

산점도(예측 vs 실험)와 RMSE 막대그래프로 평가

3J 정확도(GB3·HEWL·BPTI): AF2χ 앙상블의 3J 일치도는 AF2 단일구조·원자적 MD와 대체로 동급

GB3: BME 리웨이팅(안쪽 레이어 평균으로 prior 보정)이 약간 개선을 줌.
HEWL/BPTI: 리웨이팅 유의한 변화 없음(악화도 없음).

중요 포인트: AF2χ의 ‘prior’(AF2 마지막 레이어 가우시안 + Top8000 15%)만으로도 3J를 매우 잘 설명함
→ 간단한 prior가 이미 현실적 χ1 분포를 준다는 뜻.
BME는 더 좋아지거나(GB3) 해치지 않는다(HEWL/BPTI).

요약
AF2χ는 3J 관점에서 MD·DER에 견주는 성능을 내고, prior만으로도 강력하다. BME는 안쪽 레이어 정보를 이용해 더 나빠지지 않게(대개 유지, 일부 개선) 만드는 안전한 강화 단계.

(a) χ1, (b) χ2 — JS_div 박스플롯

가로축: 방법(AF2 단일구조 / Top8000 / MD(CHARMM36m) / NMR-정련 MD(DER) / AF2χ prior / AF2χ).

점·상자: 각 잔기별로 HSP 분포와 비교한 JS_div. 색으로 단일-웰 vs 다중-웰 잔기도 구분.

읽는 법/결과:

AF2χ(최종)와 AF2χ prior는 JS_div가 작음 → HSP에 가깝다.

AF2 단일구조/Top8000은 더 큼 → 분포 재현력이 떨어짐.

MD/DER는 AF2χ와 대체로 비슷.

다중-웰 잔기에서 AF2χ의 장점이 더 두드러짐(여러 로타머 우물 재현).

(c) 산점도(3J_AF2χ vs 3J_exp)

3가지 3J 세트(예: C–Cα–Cβ–Cγ, N–Cα–Cβ–Cγ, Hα–Cα–Cβ–Hβ 등)를 각각 표시.

대각선(이상적인 1:1)에 가깝게 분포 → 3J를 잘 맞춘다.

(d) 3J RMSE 막대그래프

방법별로 실험 대비 RMSE 비교: AF2χ(최종), AF2χ prior, AF2 단일구조, HSP·DER, MD(다양한 force field).

관찰: AF2χ(최종) ≈ MD/DER, prior도 이미 좋음. 일부 세트에서 AF2χ가 최저 RMSE.

요지: UBQ에서 분포 지표(JS)와 실험 지표(3J) 모두 AF2χ가 최상위권, prior도 강함.

(a–c) 산점도(예측 vs 실험)

각 단백질별로 AF2χ 예측 3J가 대각선 근처에 모임 → 선형 일치 양호.

(d–f) RMSE 막대그래프(방법 비교)

방법: AF2χ(최종), AF2χ prior, AF2 단일구조, HSP(있으면), MD(CHARMM36m), 과거 MD(force field: ff99SB, ff99SB-ILDN).

GB3: BME 리웨이팅 후(최종)가 prior보다 약간 더 낮은 RMSE → 안쪽 레이어 정보가 실제로 개선을 줌.

HEWL/BPTI: prior ↔ 최종 차이 거의 없음(둘 다 준수).

전반적으로 AF2χ(최종)은 AF2 단일구조·MD와 비슷한 정확도.

요지: 여러 단백질에 걸쳐 AF2χ의 3J 정확도는 MD와 동급; 리웨이팅은 ‘걸림돌 없이 안전’(개선되거나 유지).

2️⃣ NMR 메틸 S²_axis(질서 매개변수)로 검증

2-1. 단백질·지표

6개 단백질(tenascin TNfn3, fibronectin Fnfn10, A-LBP, M-FABP, A3D, Fyn SH3)에 대해 AF2χ 앙상블을 만들고 메틸 S²_axis를 계산해 실험 S²_axis와 상관(r) 비교.

지표: 메틸 S²_axis(ps–ns 범위 사이드체인 유연성)

메틸 S²_axis: ps–ns 범위 측쇄 유연성. 실험 vs 예측의 상관 r로 평가(클수록 좋음)

동일 단백질로 CHARMM36m MD도 돌려 S²_axis 계산해 비교.

2-2. 결과

AF2χ와 MD가 전반적으로 비슷한 상관을 보인다(실험 S²_axis와의 피어슨 상관).

A3D: AF2χ가 MD보다 상관↑. Fyn SH3: MD가 AF2χ보다 상관↑. (나머지는 대체로 비슷)

BME 리웨이팅 효과: 6개 중 4개 단백질에서 상관 개선, 어느 단백질도 악화 없음.

Null model(메틸 유형별 평균값만 쓰는 모델)과 비교:

메틸 S²_axis가 메틸 타입(예: Ile Cγ1)에 강하게 의존하므로, 타입 평균만 쓰는 Null 모델도 만들어 모델의 ‘구조 맥락 추가 가치’를 검증.

M-FABP, A-LBP: AF2χ·MD 둘 다 null보다 높은 상관.

Fyn SH3: MD만 null보다 높음(AF2χ는 유리함이 작거나 없음).

2-3. 해석

ps–ns 진동은 순수한 로타머 교환 외에 미세 진동·메틸 자체 회전 영향도 받아서, 사이드체인 이면각 앙상블 중심인 AF2χ는 살짝 경직 쪽으로 치우칠 수 있음.

타입 보정(null)을 넘어서는 부위별 미세 차이를 완벽히 설명하는 데는 AF2χ·MD 모두 제한이 있다.

즉, AF2χ의 S²_axis는 대체로 살짝 ‘경직’ 쪽으로 치우치는 경향(실험 대비 값이 큰 쪽) → ps–ns 유연성을 약간 과대 억제할 수 있음.

요약
S²_axis 기준으로 AF2χ ≈ MD. BME가 여러 경우 향상을 준다. 일부 단백질·메틸 유형에선 MD가 근소 우위. 전체적으로는 실험과 합리적으로 부합.

한계/주의

S²_axis: 타입 의존성이 커서 Null 모델을 반드시 함께 보정해 비교해야 함. AF2χ·MD 모두 일부 단백질에선 부위별 미세 차이를 충분히 설명하지 못함.

(a) 산점도(예측 S² vs 실험 S²)

초록(AF2χ), 노랑(prior), 빨강(MD), 회색(null: 메틸 유형 평균만 쓰는 단순 모델).

대부분 대각선 부근. 일부는 점들이 위쪽에 더 많음 → 예측이 실험보다 S²를 조금 크게(경직) 보는 경향.

(b) 상관계수 r(막대그래프)

AF2χ(최종)와 MD가 비슷한 r.

BME 리웨이팅으로 4/6 단백질에서 r 증가, 나머지 유지(악화 없음).

단백질별 특이점:

A3D: AF2χ가 MD보다 상관↑.

Fyn SH3: MD가 우세.

M-FABP, A-LBP: AF2χ·MD 둘 다 null보다 확실히 좋음.

요지: ps–ns 유연성(S²) 기준으로도 AF2χ ≈ MD, 리웨이팅이 대체로 플러스. 다만 살짝 ‘경직’ 편향은 인지.

✅ 왜 이런 결과가 나오는가?

prior가 강력한 이유

AF2 마지막 레이어의 χ(=단일 로타머 추정) 자체가 꽤 정확하고,

여기에 Top8000(15%)을 섞어 ‘흔한 로타머 우물’을 열어 둠 → 이미 현실적인 다중-웰 초안을 형성.

BME 리웨이팅의 역할

안쪽 레이어 평균이라는 약한(하지만 정보성 있는) 제약을 걸어 prior를 ‘최소 수정’.

시스템에 따라 유의 개선(GB3) 또는 유지(HEWL/BPTI). 악화는 사실상 없음 → 안전한 후처리.

S²에서 가끔 ‘경직 쪽’

χ 분포가 충분히 넓어도, S²는 다른 자유도(메틸 회전, 미세 진동) 영향도 받음.

AF2χ는 사이드체인 이면각 엔SEMBLE 중심이라 초고속(ps–ns) 미세운동을 약간 과소평가할 여지가 있음 → 살짝 큰 S²로 보이는 경향.

3️⃣ ATLAS 대규모 MD 데이터셋과의 비교

3-1. 설정

ATLAS MD: 1,390개 단백질에 대해 100 ns×3회 MD(CHARMM36m)로 얻은 χ1·χ2 분포.

비교 대상: AF2χ, AF2χ prior, AF2 구조, Top8000.

AF2χ로 같은 단백질들에 대해 χ 분포 생성(최종/ prior), 그리고 AF2 단일 구조, Top8000과 함께 MD 분포와의 JS-divergence 비교.

3-2. 결과(violin/box plots)

• MD 분포와의 유사도(JS-div)

χ1: AF2χ(최종)가 가장 MD에 가까움(JS 작음). AF2χ prior도 우수. AF2 구조/Top8000은 뒤처짐.

χ2: AF2χ > AF2 구조, Top8000과는 대체로 비슷(χ2는 본래 우물이 단순/넓음)

구조 기반(템플릿+AF2 내부 정보) 접근인 AF2χ가 원자적 MD가 만든 분포에 가장 근접.

특히 χ1(주된 로타머 결정자)에서 큰 이점.

한계/주의

χ2: 본질적으로 로타머 우물이 단순하여 Top8000만으로도 꽤 근접 → χ1에서의 이점이 모델 성능의 관건.

• 15개 단백질의 HSP 앙상블과 비교(JS-div):

ATLAS 세트 중 단일체 15개에서 서열 유사 PDB ≥10개를 찾아 HSP 앙상블 구축.

각 잔기를 단일-웰 vs 다중-웰로 분류한 뒤, AF2χ / AF2 구조 / ATLAS-MD / Top8000의 χ1/χ2 분포가 HSP 분포에 얼마나 가까운지(JS-div) 비교.

AF2χ와 ATLAS-MD가 HSP에 가장 근접, AF2 구조/Top8000은 뒤

단일-웰 잔기: AF2 구조/AF2χ/MD의 중앙값은 비슷, 다만 AF2 구조는 분산(박스 폭)이 넓음 → 일부 잔기에선 단일 구조만으로 분포 재현 실패.

다중-웰 잔기(여러 자유에너지 우물): AF2χ가 AF2 구조보다 현저히, MD보다도 약간 더 좋음.

요약
대규모 스케일에서도 AF2χ 분포가 MD(또는 HSP)에 가장 가깝거나 동급. 특히 여러 우물이 있는 잔기에서 강함.

여러 로타머를 오가는 부위에서 AF2χ의 분포 모델링이 특히 강함(HSP/MD 기준).

큰 단백질도 정확도 감소 없이 처리 → 실전 대규모 스크리닝에 적합.

(a) χ1 / (b) χ2:
좌: 각 방법의 모든 잔기에 대한 JS 분포 violin → 중앙의 박스플롯이 전체 요약.
→ 오른쪽으로 갈수록(A F2χ) JS↓ = MD와 유사↑ 경향 뚜렷.

(c) χ1 / (d) χ2:
HSP 기준 JS 박스플롯(색으로 단일-웰/다중-웰 구분).
→ 다중-웰(연한 파랑)에서 AF2χ가 최저 JS(=가장 HSP-like).

4️⃣ 계산 비용(속도)

로타머 분포 예측: ~0.25초/잔기 (단백질 커져도 선형 증가)

앙상블 생성(100개 구조) 포함 시: ~10분/100잔기 스케일

MD 대비 속도: 최대 10³배 빠름

5️⃣ 최근 생성(Generative) 모델들 vs AF2χ 비교

백본·사이드체인 앙상블을 만든다는 공통 목표 아래, HSP 앙상블과 NMR 3J로 누가 실제와 더 가까운 분포를 주는가를 본 것

5-1) 어떻게 평가했나?

분포 유사도(주평가): 각 모델이 만든 χ1/χ2 분포가 HSP 앙상블 분포와 얼마나 가까운지(JS-divergence, 작을수록 좋음).

실험 지표 보조평가: 각 모델의 엔SEMBLE에서 계산한 NMR 3J가 실험 3J와 얼마나 맞는지(RMSE, 작을수록 좋음).

5-2) 결과

AF2χ: 세 단백질(UBQ/HEWL/BPTI) 모두에서
⇒ HSP 분포와의 일치가 ‘타 모델 대비’ 가장 좋음.
⇒ 3J 정확도 비교에서도 전체적으로 가장 우수.

MDgen / BioEmu+Hpacker / aSAMT:
⇒ 생성 모델들 중에선 상대적으로 상위권(HSP 분포와 꽤 잘 맞음).

AF2 Dropout-ensemble:
⇒ AF2 ‘단일 구조’보다는 개선되지만, HSP 분포와의 일치도는 AF2χ만큼 높지 않음.
⇒ 즉, 백본 대안 상태는 잘 내지만 사이드체인 분포 재현력은 제한적.

SeqDance:
⇒ 가장 낮은 정확도. HSP 분포와 형태가 많이 다름.
⇒ 원인 추정: 서열만 입력(구조 맥락 부재) + χ-각을 30° bin으로 거칠게 양자화.

3J 비교에서도, 위 네 생성 모델(AF2 dropout, MDgen, BioEmu+Hpacker, aSAMT)을 놓고 보면 AF2χ가 전반적으로 최상의 실험 일치를 보였다고 정리됨

5-3) 왜 이런 차이가 날까?

AF2χ의 강점은 “백본을 지정(템플릿)하면 그 맥락에서의 사이드체인 ‘분포’를 복원”하는 데 최적화되어 있음.
→ HSP가 보여주는 자리별 로타머 다중성(특히 χ1)을 더 잘 재현.

반면 생성 모델들은 백본 동역학 복원에 시선이 있고, 사이드체인 분포는 패킹이나 후처리로 보완되는 경향.
→ 인터페이스/활성부처럼 다중-웰이 중요한 자리에서 로타머 분포가 흐릿해질 수 있음.

💡 Conclusions

1️⃣ AF2가 학습한 정보(우리 작업의 확장 포인트)

최근 결과, AF2는 주된 로타머 상태를 정확히 예측하며, 특히 백본에 가까운 χ에서 더 잘 맞음

논문의 연구는 이 결과를 확장하여, AF2 구조모듈의 안쪽 레이어 평균 χ 예측 속에 사이드체인 구조적 이질성(분포 정보) 에 관한 정보도 학습했음을 보여줌

이러한 정보는, 마지막 레이어 값들에서 이미 사이드체인 χ-각에 초점이 맞춰져 있고, 다양한 물리화학적 환경에서 많은 아미노산에 대한 광범위한 학습(HSP 앙상블이 용액 동역학을 반영하듯) 덕분일 가능성이 큼.

2️⃣ 벤치마크 관점(왜 NMR/HSP인가)

생성형 ML 모델들은 보통 MD나 여러 실험 구조와 비교해 평가하지만,
MD는 포스필드/샘플링 한계가 있고,
여러 실험 구조와의 비교는 상대 자유에너지를 정량화하지 못함.

따라서 용액 NMR 데이터와 HSP 앙상블은 평형 구조 이질성을 더 직접적으로 보여주는, 독립적이고 유용한 벤치마크임.

이번에 모은 데이터셋은 향후 사이드체인 동역학 예측 모델 개발에 유용할 것이라 판단

3️⃣ 잔기 간 상관(코릴레이션)과 구조 생성

1단계(분포 만들기)

AF2χ는 초기 단계에서 잔기마다 따로 “이 자리의 χ 각은 이런 확률로 나와요”라는 개별 분포 pᵢ(χ)를 만든다.
→ 이때는 이웃 잔기가 무엇을 하는지는 신경 쓰지 않는다(= 상관을 모델링 안 함).

2단계(조립)

전체 단백질을 만들 때는 각 잔기에서 하나씩 χ를 뽑아(샘플링) 한 구조로 붙인다.
→ 만약 어떤 조합이 원자끼리 심하게 겹치면(clash) 그 구조는 버린다(거부).

원칙적으로는, 구조 생성 단계에서(충돌이 있는 구조를 기각함으로써) 사이드체인들 간의 상관이 포착될 수 있음

관찰: 거의 100%가 통과

실제로는 거의 모든 샘플이 통과했다는 뜻.
→ 즉, 잔기들을 서로 독립적으로 골라도 서로 안 부딪히고 잘 맞는다는 의미.

이는 백본 구조를 완화(relax) 하면 남아 있는 입체 충돌이 해소될 수 있음을 시사하며, 작은 백본 움직임이 사이드체인 운동을 돕는다는 이전 관찰과도 부합
이웃 사이드체인 동역학 상관이 강하지 않다는 오래된 가정과도 일치

가끔 생기는 아주 사소한 겹침은 백본·본드 길이/각을 아주 조금만 움직여도 금방 풀린다.
→ 작은 백본 미세 움직임이 사이드체인 자리 잡기를 도와준다는 기존 관찰과 일치.

💡 Method

1️⃣ AF2 run setup (AF2 실행 설정)

1. 표준 AF2 세팅(Full MSA, 템플릿 없음)

• LocalColabFold v1.5.5 사용
• 풀 MSA를 사용하고 구조 템플릿은 넣지 않음
• 5개 모델 중 같은 학습 레짐의 3개(모델 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3)만 사용
• 예시 플래그:
  --msa-mode mmseqs2_uniref_env --model-order 3,4,5

“표준 구조”가 타깃일 때 적합(서열 다중정렬 신호를 최대 활용)

2. Decoy 전략(템플릿·single-sequence) — AF2χ 기본 세팅

• MSA를 완전히 제거하고(single-sequence), 사용자가 주는 커스텀 구조 템플릿으로 보강
• 원하는 템플릿 백본 주변에서 사이드체인 이면각 분포를 샘플링하고 구조 앙상블을 만들기 위함
• 예시 플래그:
  --msa-mode single_sequence --template --custom-template --model-order 1,2
  (여기서 쓰는 모델은 1.1.1, 1.1.2: 템플릿 정보를 쓰도록 훈련된 모델)

표준은 “대표 구조”를, decoy는 “주어진 템플릿 백본 주변의 상태”를 얻는 데 유리

2️⃣ Extraction of AF2 χ-angles (AF2에서 χ-각 추출)

AF2 structure module의 multi-rigid side-chain unit이 백본·사이드체인 모든 토션(χ 포함)을 각 iteration마다 계산

AF2χ에서 쓰는 값들

• 타깃 평균(앙상블 평균): 2번째~7번째(=안쪽 레이어) 예측들을 평균하여 BME의 목표 평균으로 사용
• 타깃 표준편차(불확실성): 같은 안쪽 레이어 분산으로 추정
• Prior의 중심값: 마지막 레이어(=최종 구조를 만드는 값)의 χ를 사용(최종 구조 좌표에서 다시 추출하지 않고, 마지막 레이어 예측값 자체를 씀).

3️⃣ Priors (베이지안 사전 분포)

각 χ-각에 대해 AF2 중심 가우시안 + Top8000 로타머 분포의 가중 합으로 prior를 만듦

• μAF2(last) : AF2 마지막 레이어의 χ 예측(그 잔기의 “대표 로타머”)
• σ: 아미노산·각도별로 Top8000의 주 피크들(예: Phe χ1은 3개, χ2는 2개 가우시안)을 맞춰 얻은 표준편차들을 평균해서 사용(피크 폭의 경험적 스케일).
• 가중치 α: 0~1을 0.05 간격으로 스캔하며 UBQ의 NMR 3J·HSP 분포와의 일치가 가장 좋은 값을 선택 → α=0.85 채택
• Top8000 다차원 분포 처리: 아미노산 타입별 다차원(χ1, χ2, …) 분포에서 관심 χ 하나를 제외한 나머지 χ들에 대해 적분해 단일 χ 분포를 얻음
• 계산 편의를 위해 분포를 36개 각도 bin으로 리빈닝(이산화)해 이후 BME에서 사용.

4️⃣ BME reweighting (최대엔트로피/베이지안 리웨이팅)

목표: prior 분포를 안쪽 레이어 평균 χ에 맞추되, prior에서 최소 수정이 되도록 posterior로 업데이트

prior(= AF2 85% + Top8000 15%)를 최소 수정해 “안쪽 레이어 평균”을 만족시키는 가장 보수적인 posterior 분포를 얻기 위함

• 변수: u=(u​,…,u36) = 36개 각도 bin의 확률(가중치)

• 최소화할 목적함수 (prior를 너무 바꾸지 않으면서 목표 평균을 만족):
  

• m: 타깃 데이터 포인트 수(여기선 m=1, 평균 χ 하나).

• u0: prior의 bin 확률.

• θ: prior 신뢰도 vs 타깃 데이터를 조절하는 글로벌 스케일.

• χ2(u): 타깃 평균과의 차이(원형평균 사용)의 reduced χ²
  
  χˉAF2 (inner), σAF2 (inner): 안쪽 레이어의 평균과 표준편차(타깃).
  χˉ(u): 원형 평균
  

• Srel(u∣∣u0)=∑iuilogui%0ui: 상대(샤논) 엔트로피 → prior에서 얼마나 바뀌었는지를 정량화.

• θ 선택 규칙: 1∼10,000 범위를 로그 스케일 20점으로 스캔,
  χ2≤1을 만족하는 가장 큰 θ**를 채택(= prior 존중을 최대화하면서 타깃 평균도 맞춤).

5️⃣ 정리

각 layer별로 따로 맞추는 게 아니라, 안쪽 레이어(2–7)의 ‘평균 χ’를 하나의 타깃(앙상블 평균) 으로 삼음

이때 평균은 각도가 원형값이라 원형 평균( cos, sin 평균 )으로 계산하고, 안쪽 레이어 분산(표준편차)도 함께 추정해서 불확실도(σ) 로 사용

먼저 잔기·각도(χ1, χ2…)마다 prior 분포를 만듦:
AF2 마지막 레이어 χ 중심 가우시안(85%) + Top8000 분포(15%) 의 혼합(36개 각도 bin으로 이산화).

그다음 BME 리웨이팅으로 posterior를 구함

“타깃 평균(=안쪽 레이어 평균)에 맞추되, prior에서 최대한 적게 바뀌도록” 가중치(각 bin 확률) 를 조정

안쪽 레이어의 평균·표준편차를 한 벌의 타깃(잔기·각도별)으로 삼고,

미리 만든 prior(AF2-last+Top8000)을 최소 수정해서 그 타깃 평균에 맞춘 posterior를 얻음

→ 결과적으로 각 layer에 각각 맞추는 게 아니라, 안쪽 레이어들의 평균에 한 번 맞춥니다.

6️⃣ AF2χ 분포로 앙상블 구조 만들기

1) 구조 생성 (from AF2χ distributions)
χ 분포에서 각 잔기의 이면각을 뽑아 좌표로 변환

AF2χ가 주는 잔기별 χ-각 분포에서 표본(χ1, χ2 …) 을 뽑음

뽑은 각도들을 사이드체인 강체(multi-rigid side-chain unit) 에 적용해 쿼터니언/회전으로 3D 좌표를 계산하고, AF2가 만든 백본에 붙임
→ 이렇게 해서 초안 구조 1개가 만들어지고, 이것을 반복해 여러 개(예: 100개)의 앙상블을 만듦

2) 구조 릴랙스 (OpenMM + Amber ff99SB)
짧은 에너지 최소화로 충돌 완화

표준 AF2 포스트-처리 방식처럼 Amber ff99SB 힘장으로 에너지 최소화(OpenMM)함

샘플한 χ-각이 그대로 유지되도록, 모든 χ에 주기적 토션 구속(restraint) 을 검

AF2 표준에 있는 무거운 원자 위치 구속(harmonic restraint)은 조금 약하게 설정해 백본이 약간 움직여서 사이드체인 충돌을 풀 수 있게 함

3) 충돌 검사 (원자쌍 거리 임계값)
남은 원자 충돌이면 구조 폐기

서로 다른 잔기의 모든 원자쌍에 대해, 실제 거리 d가 아래 임계거리보다 짧으면 충돌로 간주해 그 구조를 버림

𝑑min: “최소 허용 여유”를 나타내는 상수(논문에서는 고정값 사용)
→ 요지는 릴랙스 후에도 너무 가까우면 폐기한다는 것.

4) 입력 백본에서의 이탈 제한 (상대 RMSD 기준)
AF2 기준 구조에서 너무 멀어지지 않았는지 RMSD로 필터

릴랙스된 구조가 원래 AF2 기준 구조에서 너무 멀어지지 않았는지 확인

단백질 길이 𝑁가 커지면 RMSD 허용치도 완만히 늘어나도록 한 상대 RMSD 기준을 씀(문헌식 스케일링).

실제 RMSD가 RMSDrel,max 이하면 채택, 크면 폐기
→ 그래서 짧은 단백질은 더 빡빡, 긴 단백질은 조금 더 관대하게 필터링

7️⃣ NMR ³J-couplings 계산

실험 ³J 데이터
UBQ, HEWL, BPTI, GB3에 대해 문헌(Lindorff-Larsen et al., 2010)이 모아둔 값을 사용

어떤 ³J를 썼나(잔기·결합 유형)

• 네 단백질 모두: Hα–Cα–Cβ–Hβ의 ²,³J
• GB3·UBQ: N–Cα–Cβ–Cγ, C′–Cα–Cβ–Cγ의 ³J
• HEWL: C′–Cα–Cβ–Hβ₁,₂의 ³J

어떻게 계산했나

모든 ³J는 χ1 이면각에서 Karplus 식으로 계산:

평가 방법

AF2χ 앙상블에서 계산한 ³J와 실험값의 RMSE 비교

8️⃣ NMR 메틸 S²_axis(질서 매개변수) 계산

실험 S²_axis:
Fyn SH3(Mittermaier et al., 2003), TNfn3·Fnfn10(Best et al., 2004), A-LBP·M-FABP(Constantine et al., 1998), A3D(Walsh et al., 2001).

AF2χ 앙상블 템플릿(예시): A-LBP 2HNX, M-FABP 1HMT, Fnfn10 1FNF, TNfn3 1TEN, A3D 2A3D, Fyn SH3 1SHF 등 문헌 구조.

S²_axis: 메틸 C–C 축의 방향성이 앙상블에서 얼마나 고정/흔들리는지를 나타내는 값(0~1)
앙상블 구조들의 결합 벡터 성분으로 위 공식을 적용
→ 실험과의 상관으로 평가