✅ Abstract
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단백질 구조 예측은 많이 발전했지만, 단백질이 unfolded conformation에서 native state까지 어떤 경로로 접히는가는 아직 해결되지 않았다는 문제에서 출발
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즉, 최종 구조를 맞히는 문제와 folding pathway, 즉 접힘 과정 자체를 모델링하는 문제를 구분
-
기존 딥러닝 방법들은 주로 equilibrium ensemble, 즉 안정 상태 또는 준안정 상태들의 분포를 샘플링하는 데 초점
-
반면 PathDiffusion은 folding의 temporal evolution, 즉, 시간적 진행 과정을 명시적으로 모델링
제안 방법: PathDiffusion (evolution-guided diffusion model)
(1) AlphaFold database에 있는 약 5,200만 개의 predicted structures로부터 구조를 반영한 evolutionary information을 추출
여기서 단순 sequence conservation만 보는 것이 아니라, homologous protein들의 predicted structure를 함께 활용한다는 점이 중요
(2) 이 evolutionary information을 바탕으로 dual-score fusion strategy를 사용하는 diffusion model을 학습하여 high-fidelity folding pathway를 생성
dual-score fusion
sequence-conditioned score와 unconditional score를 함께 사용해서 folded state 쪽으로 가는 정보와 unfolded/disordered state 쪽 정보를 균형 있게 반영하는 전략
PathDiffusion은 실험적으로 검증된 folding pathway를 가진 52개 단백질 benchmark에서 folding event의 순서를 정확히 재구성
-> 즉, 단순히 최종 구조가 native-like인지 보는 것이 아니라, “어떤 region이 먼저 접히고 어떤 region이 나중에 접히는가”라는 folding order가 평가 대상
✅ Introduction
- 단백질 folding pathway가 중요한 이유
단백질이 실제로 어떻게 접히는지, 즉 protein folding pathway를 이해하는 것은 중요한 난제
최종 native structure만 알아서는 부족하다.
단백질이 접히는 중간 상태와 그 순서를 알아야 기능, 오작동, 질병 관련 aggregation까지 이해할 수 있다.
ex) Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease
- 기존 실험 방법의 한계
실험 방법은 정확하지만 scalable하지 않고,
MD는 원리적으로 강력하지만 계산 비용과 시간 scale 문제가 큼
- 기존 딥러닝 / generative AI 방법의 한계
여러 가능한 conformations를 샘플링할 수는 있지만, unfolded state에서 native state로 이어지는 continuous folding trajectory를 재구성하는 데에는 충분하지 않음
(1) FoldPAthreader는 folding force field 기반 conformation sampling을 통해 potential intermediates를 탐색
(2) generative world models는 latent spatiotemporal representation을 학습하여 latent space에서 folding simulation을 진행하려는 접근
(3) iterative AlphaFold2 strategy는 sequence만을 이용해 AlphaFold2의 implicit energy landscape를 활용하여 folding pathway를 추정하려는 방법
generalizable data-driven framework를 만드는 것은 여전히 어려움
(1) high-resolution experimental folding data가 부족
(2) MD로 comprehensive training set을 만드는 것은 계산적으로 비현실적
- PathDiffusion이 해결하려는 빈틈
핵심 가정은 evolution과 protein dynamics 사이에 근본적인 관계가 있다는 것
-> 이것은 뒤에서 PSNS (position-specific noise schedule) 로 구현됨
보존적인 residue는 상대적으로 안정적인 구조를 빨리 형성하고, 변이가 많은 residue는 더 오래 flexible하게 남는다는 식으로 folding trajectory를 유도
- 논문에서 평가하는 데이터셋
(1) 52개 단백질의 experimental folding pathway evidence를 가진 benchmark에서 성능을 평가
(2) Anton supercomputer MD simulation으로 얻은 fast-folding proteins의 trajectory와 비교
(3) local folding-unfolding transition proteins에 적용
(4) intrinsically disordered proteins와 TIM-barrel proteins에 적용해 broader protein dynamics landscape를 탐색할 수 있음을 보임
✅ Results
✅ Overview of PathDiffusion
- PathDiffusion은 크게 두 module로 구성
(1) evolutionary information으로부터 position-specific noise schedules, PSNS를 준비하는 부분
(2) 이 PSNS를 이용해 evolution-guided diffusion model로 folding pathway를 생성하는 부분
- Module 1: evolutionary information에서 PSNS 만들기
입력은 단백질 sequence
(1) target protein sequence에 대해 homologous sequence를 찾음
이때 AFDB50, 즉 AlphaFold database에서 50% sequence identity 기준으로 clustering된 구조 database를 사용하고, 검색 도구로는 MMseqs2와 JackHMMER를 사용
(2) 단순 MSA만 만드는 것이 아니라, AFDB50에서 찾은 homolog들의 predicted structure를 정렬해서 MSTA, multiple structure alignment를 만듦
이후 MSTA에서 관찰되는 structural consensus와 variation을 바탕으로 residue별 PSNS를 계산
중요한 포인트는 PSNS가 단순한 sequence conservation score가 아니라는 점
저자들은 homologous structures의 structural agreement / variation을 이용해서, 각 residue가 folding 과정에서 얼마나 빨리 안정화될지를 diffusion noise schedule에 반영
보존적이고 구조적으로 일관된 residue → 빨리 denoise됨 → folding 초기에 안정화
가변적이고 flexible한 residue → noise를 오래 유지 → folding 후반까지 유연하게 남음
- Module 2: two-stage diffusion으로 folding pathway 생성
unfolded state에서 folded state로 가는 동적 과정을 생성
-> evolution-guided two-stage diffusion model
Stage 1: sequence-conditional diffusion model
- Gaussian noise에서 시작
- 이후 T step 동안 evolution-guided reverse denoising을 수행
- 이때 PSNS가 residue별 denoising 속도를 조절
보존적인 residue는 빠르게 denoise되어 early step에서 stable local structure를 형성하고, flexible residue는 noise를 더 오래 유지
Stage 1의 결과는 하나의 최종 구조만이 아님
각 denoising step의 구조들이 모여 continuous trajectory를 만듦
step 1: 완전한 Gaussian noise에 가까운 상태
step 2 ~ T-1: 부분적으로 접힌 intermediate states
step T: fully folded structure
Stage 2: conditional + unconditional model로 trajectory refinement
- unconditional diffusion model을 sequence-conditional model과 함께 사용
- 목적은 Stage 1에서 생성된 trajectory dynamics를 refinement하는 것
여기서 adaptive weighting이 사용
Stage 1 trajectory에서 얻은 정보를 바탕으로 residue별 weight를 만들고, 이 weight가 sequence-conditional model과 unconditional model의 기여도를 조절
- sequence-conditional score: native folded state 쪽으로 구조를 끌고 감
- unconditional score: unfolded / disordered conformation 쪽 특성을 반영
- adaptive weight: residue별로 둘 사이의 균형을 조절
-> 이 구조가 dual-score fusion strategy
- Figure 1
Figure 1A: 전체 workflow
위쪽 module: input sequence에서 출발해 MSA를 만들고, AFDB50 structure들을 정렬해 MSTA를 만든 뒤, PSNS를 계산하는 흐름
아래쪽 module: diffusion 기반 pathway generation
Stage 1에서는 sequence-conditional model이 Gaussian noise에서 folding trajectory를 만들고, Stage 2에서는 sequence-conditional model과 unconditional model을 함께 써서 trajectory를 refine
Figure 1B: adaptive dual-score fusion
Stage 2에서 두 score model을 어떻게 섞는지를 보여줌
조건부 모델은 sequence 정보를 이용해 native folded state로 향하는 score를 제공하고, unconditional model은 unfolded/disordered conformation을 반영하는 score를 제공
이 둘을 residue-specific weight w로 섞어서 최종 score를 만듦
이 패널의 핵심은 PathDiffusion이 folding pathway를 만들 때 단순히 native structure로 빨리 수렴시키는 것이 아니라, disordered / intermediate state의 특성도 유지하도록 설계되었다는 점
Figure 1C: evolution-guided diffusion process
PSNS가 forward noising과 reverse denoising에 어떻게 들어가는지를 설명
PSNS에 따라 residue마다 noise가 들어가고 제거되는 속도가 다름
보존적인 region은 더 빠르게 구조화되고, variable region은 더 오래 noisy/flexible하게 남음
이로써 folding event의 순서가 residue별 evolutionary signal에 의해 유도됨
Figure 1D: single-step denoising architecture
한 번의 denoising step에서 모델이 어떤 input을 받는지 보여줌
noisy conformation, timestep embedding, sequence 또는 masked sequence, ESM-derived feature 등이 structure module에 들어가고, 다음 denoised conformation을 예측
이 section의 핵심 의미
PathDiffusion은 evolutionary information을 residue별 noise schedule로 바꾸고, 이를 diffusion process에 넣어 folding trajectory를 생성
즉, 기존 diffusion model처럼 모든 residue를 같은 방식으로 noising/denoising하는 것이 아니라, residue별 evolutionary stability를 folding 순서에 반영한다는 점이 가장 중요
✅ Performance of PathDiffusion
- 평가 benchmark는 FP52
FP52는 folding order가 실험적으로 characterization된 52개 단백질로 구성
각 protein에 대해 저자들은 실험 근거를 바탕으로 EFRs, early folded regions와 LFRs, late folded regions를 annotation
여기서 평가의 핵심은 최종 구조만 잘 맞히는 것이 아님
EFR이 LFR보다 먼저 안정화되는가?
이것이 PathDiffusion의 folding pathway prediction 성능을 판단하는 핵심 기준
- Figure 2A: dihedral angle evolution
PathDiffusion trajectory를 따라 backbone dihedral angle인 ϕ, ψ가 어떻게 변하는지를 보여줌
reference Ramachandran plot 두 개를 사용
(1) 첫 번째 reference는 unfolded state에 해당
이는 human proteome의 intrinsically disordered regions, IDRs 약 24,000개 구조에서 얻은 것
(2) 두 번째 reference는 folded state에 해당
이는 PDB에서 random하게 선택한 20,000개 구조에서 얻은 것
PathDiffusion이 생성한 trajectory의 dihedral distribution은 파란색으로 표시
초기 step 1–10에서는 분포가 넓게 퍼져 있고, 이는 highly unfolded starting conformation과 잘 맞음
denoising이 진행되면서 ϕ, ψ 분포가 점차 folded structure에서 흔히 나타나는 영역, 예를 들어 β-strand나 α-helix 영역으로 모임
마지막 step 290–300에서는 PDB folded structure의 Ramachandran pattern과 유사하게 강하게 수렴
PathDiffusion의 trajectory는 단순한 구조 보간이 아니라,
high-entropy disordered state에서 low-entropy folded state로 점진적으로 이동하는 folding-like transition을 보인다.
- 비교 대상 method들
세 가지 기존 folding pathway prediction method와 비교
FoldPAthreader, AlphaFolding, Pathfinder
PathDiffusion과 FoldPAthreader는 continuous folding trajectory를 sample하는 방법이고, AlphaFolding과 Pathfinder는 discrete folding intermediates만 sample하는 방법으로 구분
PathDiffusion에서는 초기 50 step과 마지막 50 step을 제외하고, 중간 200개 conformation만 사용
이는 너무 unfolded인 시작부와 거의 native인 끝부분을 제외하고 실제 folding transition이 일어나는 구간을 평가하기 위한 것
FoldPAthreader에서는 initialization과 finalization stage를 제거하고 folding nucleation stage만 남김
AlphaFolding과 Pathfinder는 lDDT threshold 0.9 기준 clustering으로 redundant structure를 제거하고 representative conformation을 선택
- 평가 지표: TPC, TPC ratio, success rate
각 conformation마다 native state를 기준으로 EFR lDDT(먼저 접히는 영역) 와 LFR lDDT (나중에 접히는 영역)를 따로 계산
어떤 conformation에서 EFR의 lDDT가 LFR의 lDDT보다 10% 이상 높으면, 그 conformation을 TPC, true positive conformation으로 분류
TPC
초기 접힘 region은 이미 native-like하게 안정화되었지만, late region은 아직 덜 접힌 상태
-> 이는 실험적으로 알려진 folding order와 일치하는 intermediate라고 볼 수 있음
예측 pathway가 성공했다고 판단하려면 두 조건을 만족해야 함
(1) TPC ratio가 0.5보다 커야 한다.
전체 conformation 중 절반 이상이 올바른 folding order를 보여야 함
(2) 최종 구조의 TM-score가 지정된 threshold를 넘어야 함
pathway order만 맞아서는 안 되고, 최종 folded structure도 충분히 좋아야 함
- Figure 2B: success rate 비교
TM-score threshold를 여러 수준으로 바꿨을 때 각 method의 success rate를 비교
PathDiffusion은 모든 TM-score threshold에서 가장 높은 success rate를 보임
-> folding order와 final structure quality를 동시에 고려한 기준에서 가장 좋은 성능
- Figure 2C: structure quality
PathDiffusion이 folding order뿐 아니라 구조 품질도 좋다는 것을 보여줌
Pathfinder처럼 최종 구조 근처를 많이 만들 수 있어도, folding order를 잘 재현하지 못하면 folding pathway prediction으로는 부족
PathDiffusion의 장점은 near-native structure를 많이 만들면서도 EFR → LFR의 순서를 상대적으로 잘 보존한다는 점
- Figure 2D: 1AB7_A case study
EFR lDDT와 LFR lDDT를 step별로 비교
-> EFR이 LFR보다 훨씬 먼저 높은 lDDT를 달성
즉, EFR이 먼저 stable structure를 형성하고, LFR은 이후에 따라 접힘
중간 step에서 EFR lDDT는 이미 상당히 높지만 LFR lDDT는 낮다.
마지막 step 300에서는 EFR과 LFR 모두 높은 lDDT를 보이며 최종 구조 TM-score도 높게 나타난다.
- Figure 3: 성공적으로 예측된 31개 protein의 folding order (TM-score ≥ 0.5 조건)
Blue: early folding regions
Pink: late folding regions
색 gradient는 각 residue가 final state와 3 Å 이내로 정렬되는 sampled conformation의 비율을 기반으로 함
즉, 어떤 residue가 trajectory 중 얼마나 빨리 final-like 위치에 도달하는지를 색으로 나타낸 것
Apo-azurin, BPTI, PDZ-3 domain, CTL9, Ribonuclease H, FKBP12, Apomyoglobin, Fyn SH3 domain, CspB, T4 lysozyme, Thioredoxin, RNase T1, sIGPS, Aldolase, Tryptophan synthase 등
다양한 protein이 포함
-> PathDiffusion의 성능이 특정 예시 하나에 국한되지 않고, 여러 protein에서 folding order를 residue-level로 시각화할 수 있다는 것
✅ PathDiffusion recapitulates molecular dynamics trajectory generated on the Anton supercomputer
PathDiffusion이 folding pathway만 잘 만드는 것이 아니라, MD simulation에서 관찰되는 conformational distribution도 잘 재현하는지 평가
평가 dataset은 MD12
MD12는 Anton supercomputer에서 extensive MD simulation이 수행된 12개의 fast-folding proteins로 구성
비교 대상은 BioEmu
BioEmu는 conformational ensemble generation에 강한 모델로, 두 sampling scale로 비교
BioEmu-3×10²: 300 conformations
BioEmu-1×10⁴: 10,000 conformations
PathDiffusion은 각 protein마다 300개 conformation으로 이루어진 continuous folding pathway를 생성
- 평가 지표: Jensen-Shannon distance, JSD
PathDiffusion이 생성한 distribution이 MD reference distribution과 얼마나 비슷한지 평가하기 위해 Jensen-Shannon distance, JSD를 계산
JSD는 0에서 1 사이 값이고, 낮을수록 MD distribution과 더 유사
세 가지 projected feature dimension에서 JSD를 계산
(1) PWD (Pairwise distance between Cα atoms)
단백질 내 residue 간 거리 분포를 보며, 전체 구조적 배치를 반영
(2) RG (Radius of gyration)
단백질이 얼마나 compact한지, 또는 expanded되어 있는지를 나타냄
(3) TIC (Time-lagged independent components)
MD trajectory의 dynamics를 low-dimensional하게 표현하는 좌표
folding/unfolding transition의 주요 동역학 축을 보는 데 사용
- Figure 4A: 평균 JSD 비교
12개 protein에 대해 MD ground truth와 generated ensemble 사이의 JSD를 비교
결과적으로 PathDiffusion은 세 feature dimension 모두에서 BioEmu보다 낮은 JSD를 보임
| Metric | BioEmu-3×10² 대비 PathDiffusion JSD 감소 | BioEmu-1×10⁴ 대비 PathDiffusion JSD 감소 |
|---|---|---|
| PWD | 약 28.5% | 약 24.5% |
| RG | 약 62.2% | 약 59.2% |
| TIC | 약 30.5% | 약 21.9% |
- Figure 4B: BioEmu와 head-to-head 비교
PathDiffusion과 BioEmu의 JSD를 protein별로 scatter plot으로 비교
점이 diagonal 위에 있으면 PathDiffusion이 MD ground truth에 더 가까운 distribution을 만든다는 뜻
평균값 하나만 좋아진 것이 아니라, 여러 protein에서 일관되게 PathDiffusion이 MD distribution에 더 가까움
- Figure 4C–E: free energy surface 분석
MD-simulated ensemble과 PathDiffusion folding trajectory를 sampling step별로 시각적으로 비교
sampled conformations를 MD-derived 2D free energy surface 위에 projection한 그림
PathDiffusion이 생성한 conformations는 low-energy basin과 transition region을 넓게 덮으며, MD data와 상당히 겹침
BioEmu는 BBA에서는 비교적 괜찮지만, 다른 protein들에서는 native state 근처의 좁은 region에 제한되는 경향이 있음
BioEmu는 equilibrium 또는 metastable state sampling에 강하지만, folding 중간 ensemble을 충분히 넓게 탐색하지 못할 수 있음
반면 PathDiffusion은 unfolded → intermediate → folded로 이어지는 trajectory를 만들기 때문에 transition region도 더 잘 커버한다고 주장함
protein별 JSD 값
- Protein별 folding mechanism 해석
free energy surface와 trajectory 분석을 바탕으로 몇 가지 protein의 folding mechanism도 언급
Protein G와 BBA에서는 유사한 folding mechanism이 나타난다. 먼저 helical structure가 형성되고, 이후 β-sheet assembly가 일어남
λ-repressor에서는 helix 1의 앞쪽 절반과 helix 3, helix 4가 먼저 형성되고, 나머지 helices가 뒤따라 assembly
Villin에서는 helix 1 → helix 2 → helix 3의 sequential formation이 나타남
-> 즉, PathDiffusion은 단순히 MD distribution과 통계적으로 비슷한 구조들을 만드는 데 그치지 않고, protein별 folding event의 순서도 어느 정도 해석 가능하게 제공
- 이 section의 핵심 의미
PathDiffusion은 MD simulation data로 직접 training/fine-tuning하지 않았음에도, Anton MD trajectory에서 얻은 conformational distribution과 잘 맞는 folding pathway를 생성한다.
BioEmu와 비교했을 때 PathDiffusion은 단순히 native-like ensemble만 만드는 것이 아니라, unfolded state, transition region, low-energy basin을 함께 포괄하는 trajectory를 만든다.
✅ PathDiffusion reproduces local folding-unfolding transitions
PathDiffusion이 전체 단백질 folding pathway뿐 아니라, 특정 region에서 일어나는 local folding-unfolding transition도 재현할 수 있는지 평가
- local folding-unfolding transition이 생물학적으로 중요하다
특정 region의 국소적 접힘과 풀림은 signaling switch, autoinhibition mechanism 같은 기능 조절과 관련될 수 있기 때문
- 데이터셋과 비교 방법
평가 데이터셋은 LT20
LT20은 BioEmu study에서 유래한 데이터셋으로, local folding-unfolding transition을 겪는 것으로 알려진 20개 단백질을 포함
비교 대상은 다음 세 모델
BioEmu, DIG, AlphaFlow
PathDiffusion에서는 local unfolding이 보통 folding 후반부나 equilibrium fluctuation과 관련된다고 보고, second stage의 step 100–300에서 conformation을 sampling
평가는 두 sampling scale에서 수행
작은 규모: 200 conformations
큰 규모: 10,000 conformations
이 설정이 중요한 이유는, PathDiffusion을 “초기 unfolded → final folded” trajectory generator로만 쓰는 것이 아니라, 후반부 trajectory에서 나타나는 국소적 fluctuation까지 ensemble처럼 분석하려 하기 때문
- 평가 지표: FNC (fraction of native contacts) 와 coverage
BioEmu 연구의 정의를 따라 FNC를 사용
공정한 비교를 위해, local region이 아닌 non-local regions는 folded 상태를 유지하는 sample만 고려
성공 sample의 기준
locally unfolded state: local FNC < 0.3
folded state: local FNC > 0.7
sample들을 local FNC 기준으로 ranking한 뒤, top 1% sampled conformations 안에서 성공 conformation이 얼마나 포함되는지를 coverage로 측정
이 평가는 단순히 구조가 다양한지를 보는 것이 아니라, 기능적으로 의미 있는 “부분적으로 풀린 상태”와 “완전히 접힌 상태”를 얼마나 잘 찾아내는지를 보는 것
- Figure 5A: locally unfolded state 탐지 성능
PathDiffusion은 많은 sample을 뽑지 않아도, local unfolding transition과 관련된 rare 또는 functionally relevant state를 상대적으로 잘 찾아냄
- Figure 5B: folded state 탐지 성능
중요한 점은 PathDiffusion이 folded state만 잘 찾는 모델이 아니라, unfolded local state까지 함께 잡는다는 것
10,000 samples로 늘려도 비슷한 trend가 관찰
PathDiffusion이 massive sampling 없이도 conformational landscape를 효율적으로 탐색할 수 있음을 보여주는 근거
- Figure 5C: 세 가지 생물학적 case study
local folding-unfolding transition이 잘 알려진 세 단백질 예시
native structure에서 local unfolding을 겪는 특정 region을 pink segment로 표시
Case 1: Cyanobacteriochrome GAF3 domain, Slr1393 / P73184
Case 2: PRDC / Gremlin-2, O88273
Case 3: Human frataxin, Q16595
- 이 section의 핵심 의미
PathDiffusion은 structurally accurate conformation을 생성할 뿐 아니라, 기능적으로 중요한 local flexibility와 local folding-unfolding transition을 안정적으로 식별할 수 있다.
✅ PathDiffusion characterizes conformational ensembles of intrinsically disordered proteins
PathDiffusion이 structured protein뿐 아니라 intrinsically disordered proteins, IDPs의 conformational ensemble도 잘 다룰 수 있는지 평가
IDP는 고정된 단일 native structure가 아니라, 다양한 conformation을 오가는 heterogeneous ensemble을 가짐
따라서 folding pathway prediction과는 다른 방식의 평가가 필요
- Figure 6A: RMSF 변화
300-step trajectory 동안 평균 RMSF, root-mean-square fluctuation가 어떻게 변하는지를 보여줌
structured protein은 첫 약 100 step 안에 RMSF가 빠르게 낮아짐
이후 낮은 RMSF 수준에서 안정화되며, 이는 rigid하고 native-like한 상태로 수렴했다는 뜻
반면 IDP는 300-step 전체에서 훨씬 높은 RMSF를 유지
Structured protein은 PathDiffusion trajectory 후반부에서 안정적인 native-like structure로 수렴하지만, IDP는 final step 근처에서도 계속 큰 structural fluctuation을 유지
-> 즉, PathDiffusion이 모든 input을 무조건 compact folded structure로 붕괴시키는 것이 아니라, IDP의 disordered nature를 유지한다는 주장
- Figure 6B: Radius of gyration, Rg 변화
trajectory 동안 radius of gyration, Rg가 어떻게 변하는지를 보여줌
structured protein은 folding이 진행되면서 compact해지고, 상대적으로 작은 Rg 값을 가짐
반면 IDP는 지속적으로 더 큰 Rg 값을 보임
이는 IDP가 expanded하고 heterogeneous한 conformational ensemble을 가진다는 특성과 일치
RMSF가 “얼마나 많이 흔들리는가”를 보여준다면, Rg는 “전체 구조가 얼마나 퍼져 있는가”를 보여줌
두 지표 모두 IDP가 structured protein과 구별되는 특성을 유지한다는 방향
- Figure 6C: contact degree와 intra-ensemble lDDT의 관계
residue별 contact degree와 intra-ensemble lDDT의 상관관계를 분석
contact degree는 native contact를 기준으로 어떤 residue가 주변 residue들과 얼마나 많은 접촉을 갖는지를 나타냄
intra-ensemble lDDT는 generated ensemble 안에서 해당 residue가 얼마나 구조적으로 일관적인지를 나타내는 지표
contact degree가 높은 residue → intra-ensemble lDDT가 높음 → 구조적으로 안정적
contact degree가 낮은 residue → intra-ensemble lDDT가 낮음 → 유연성이 높음
PathDiffusion이 locally ordered motif와 fully disordered region을 구분할 수 있다고 주장
- Figure 6D, E: RALF8 peptide case study
experimentally resolved NMR ensemble이 PDB에 존재하는 IDP 예시를 분석
Arabidopsis thaliana RALF8 peptide, PDB ID 6NU4
이 peptide는 대부분 disordered하지만, residue 20–30 구간에 짧은 locally ordered segment를 가짐
PathDiffusion은 이 짧은 structured segment를 효과적으로 식별하면서도, peptide 전체의 disordered behavior를 잘 포착한다고 설명
PathDiffusion은 IDP 전체를 무작위 coil처럼만 보는 것이 아니라, IDP 안에 존재하는 짧은 locally structured motif도 구분해낼 수 있다고 주장
- 이 section의 핵심 의미
PathDiffusion은 stable structural element와 flexible disordered region을 동시에 모델링할 수 있으며, IDP의 expanded하고 heterogeneous한 conformational landscape를 재현할 수 있다.
✅ PathDiffusion resolves distinct folding mechanisms in TIM-barrel proteins
topology가 비슷한 단백질들 사이에서도 PathDiffusion이 서로 다른 folding mechanism을 구분할 수 있는지 평가
대상은 TIM-barrel proteins
TIM-barrel은 8개의 parallel β-strand가 중심 barrel을 이루고, 주변을 8개의 α-helix가 둘러싸는 매우 보존적인 topology
하지만 같은 TIM-barrel fold를 가져도 folding mechanism은 서로 다를 수 있음
| Protein | PDB ID | 설명 |
|---|---|---|
| sIGPS | 2C3Z | indole-3-glycerol phosphate synthase |
| αTS | 1BKS | α-subunit of tryptophan synthase |
| Aldolase | 1ADO | rabbit muscle aldolase |
이 세 protein은 구조적으로는 비슷 (평균 TM-score는 0.63)
하지만 sequence identity는 낮아서 평균 0.19이고, folding intermediates는 HX-MS, 즉 hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry로 잘 characterization되어 있음
- Figure 7A: sIGPS의 center-first folding mechanism
- Figure 7B: αTS의 N-terminal-first folding mechanism
- Figure 7C: Aldolase의 복잡한 folding hierarchy
- 이 section의 핵심 의미
PathDiffusion은 같은 TIM-barrel topology를 가진 단백질들 사이에서도 서로 다른 folding mechanism을 구분할 수 있다.
✅ Ablation studies
(1) evolution-informed noise schedule (PSNS)
(2) sequence-conditional score model
기본 PathDiffusion은 TPC threshold 0.5에서 59.6% success rate
evolution-informed noise schedule과 score model을 모두 제거하면 success rate가 11.5%까지 떨어짐
PathDiffusion의 성능은 PSNS 때문인가, sequence-conditional score model 때문인가, 아니면 둘의 조합 때문인가?
- Evolution-informed noise schedule, PSNS ablation
target sequence를 predicted secondary structure 기준으로 segment로 나누고, 각 segment 안 residue에 random noise schedule을 부여
이 경우 success rate는 기본 모델의 59.6%에서 28.8%로 크게 감소
-> residue별 folding timing을 무작위로 주면 folding pathway reconstruction이 크게 망가진다는 뜻
“일반적인 물리적 규칙만으로 PSNS를 대체할 수 있는가?”를 보기 위해 rule-based noise schedule도 실험
rule-based schedule은 두 가지 규칙을 넣음
(1) N-terminus에서 C-terminus 방향으로 순차적 folding order를 부여
(2) secondary structure hierarchy를 넣어 α-helix, β-sheet, loop에 서로 다른 noise 수준을 부여
하지만 이 rule-based schedule은
- 낮은 TPC threshold에서는 random schedule보다 낫지만,
- 높은 threshold에서는 random과 비슷하고,
- 전체적으로 full model에는 크게 못 미침
-> 일반적인 물리 규칙만으로는 MSTA에서 얻은 position-specific evolutionary signal을 대체할 수 없다고 해석
PSNS는 단순한 heuristic이 아니라, target protein의 homologous structure variation에서 나온 residue-specific signal이기 때문에 folding pathway를 올바르게 guide하는 데 중요하다.
- Sequence-conditional score model ablation
learned sequence-conditional score 대신, static ground-truth structure에서 직접 계산한 score를 사용
원래 PathDiffusion은 neural network가 “지금 noisy한 구조를 어느 방향으로 고쳐야 하는지”를 예측
-> 이게 learned sequence-conditional score
즉, sequence 정보를 보고 “이 단백질은 이런 식으로 접혀야 한다”는 denoising 방향을 모델이 학습해서 제시하는 것
ablation에서는 이 learned model을 빼고, 대신 정답 native structure를 이미 알고 있다고 가정하고, 그 정답 구조로부터 수학적으로 계산한 denoising 방향을 넣어봄
원래 모델:
“학생이 문제 푸는 법을 배워서, 중간 풀이를 스스로 찾아감.”
ablation 설정:
“정답지를 보고, 현재 답안을 정답 쪽으로 직접 밀어줌.”
이 변경을 하면 TPC threshold 0.5에서 success rate가 34.6%로 감소
정답 구조를 알고 있으면 더 좋아야 하는 거 아닌가?
No, 이 평가는 “최종 구조를 맞히는가”만 보는 게 아니라, 접히는 순서가 맞는가를 보기 때문
정답 native structure에서 직접 계산한 score는 basically 이렇게 말하는 정보
“모든 residue를 최종 native structure 쪽으로 denoise해라.”
하지만 folding pathway에서는 중요한 게
“어떤 residue는 먼저 접히고, 어떤 residue는 나중에 접혀야 한다.”
static ground-truth structure는 최종 완성 구조만 알려줄 뿐, 어떤 부분이 먼저 접히는지, 어떤 중간 상태를 거치는지는 알려주지 못함
그래서 final native geometry만 보고 계산한 score는 folding dynamics를 잘 반영하지 못하는 것
반면 learned sequence-conditional score model은 training을 통해 sequence, structural prior, evolutionary context 등을 이용해서 “이 단백질은 어떤 residue가 더 안정적이고 어떤 부분이 flexible한지”를 더 잘 반영한다
정적인 native geometry에서 나온 prior만으로는 folding dynamics를 충분히 설명할 수 없다.
learned score model은 단순히 native structure를 향해 denoising하는 정보만 담고 있는 것이 아니라, sequence와 evolutionary context로부터 folding dynamics에 관련된 정보를 학습했다는 주장
sequence-conditional score model은 native structure의 정적 기하학보다 folding dynamics에 더 적합한 learned signal을 제공한다.
- Figure 8A: component별 success rate 비교
- Figure 8B: 두 component의 상보성
한 component만 사용하는 모델들의 TPC distribution을 보면 두 component가 서로 보완적이라는 점이 확인됨
-> 어떤 target에서는 PSNS가 더 중요하고, 어떤 target에서는 sequence-conditional score model이 더 중요할 수 있음
-> 둘을 결합할 때 pathway reconstruction이 훨씬 좋아짐
- Score model 자체의 generative capability 평가
두 score model이 각각 어떤 generative capability를 갖는지도 평가
(1) sequence-conditional score model
(2) unconditional score model
- Figure 8C: sequence-conditional model이 EFR/LFR flexibility를 구분하는가
generated equilibrium ensemble 안에서 EFR과 LFR의 RMSF를 비교
sequence-conditional model이 intrinsic structural flexibility를 포착한다는 근거
-> late-folded region은 보통 functional dynamics 중 더 높은 conformational diversity를 보이며, 모델이 이 차이를 학습했다는 것
- Figure 8D: unconditional model이 IDP-like scaling을 학습했는가
protein length와 Rg의 관계
Rg 값은 protein length가 길어질수록 증가
-> intrinsically disordered protein에서 관찰되는 통계적 scaling law와 잘 맞음
->
unconditional model이 특정 sequence의 native fold를 예측하는 모델이라기보다, expanded/disordered conformation을 지배하는 일반적인 physical property와 spatial scaling constraint를 학습했다는 근거
- Figure 8E: representative conformational ensembles
sequence-conditional model이 생성한 representative conformational ensembles
✅ Analysis of computational efficiency
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40 GB memory를 가진 A100 GPU에서 local로 수행
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10,000개 conformation을 3시간 이내에 sampling
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비슷한 ensemble을 만들기 위해 all-atom MD simulation은 2,000–100,000 GPU hours가 필요하다고 보고되어 있음
PathDiffusion은 같은 목적에서 약 10,000배에서 100,000배 수준의 가속을 달성
✅ Conclusions
- PathDiffusion은 amino acid sequence로부터 continuous protein folding pathway를 직접 예측하는 generative diffusion framework다.
핵심은 residue-level evolutionary information을 two-stage diffusion process에 통합한다는 점
이를 통해 folding pathway를 효율적으로 탐색하면서도 native-state accuracy를 유지한다고 주장
- training이나 fine-tuning에 MD simulation data를 사용하지 않음
한계
- 한계 1: evolutionary context 의존성
현재 framework가 MSA와 homologous structure에 의존한다는 점
evolutionary information을 추정하기 위해 MSA와 AFDB homologous structures를 사용
따라서 evolutionary context가 부족한 orphan protein이나 de novo designed protein에서는 정확도가 떨어질 수 있음
-> predicted features를 이용한 single-sequence dynamical inference를 제안
즉, homolog가 부족해도 단일 sequence만으로 dynamics를 추론할 수 있는 방향이 필요하다는 것
- 한계 2: diffusion step은 실제 물리적 시간이 아님
PathDiffusion의 diffusion step은 folding 과정의 abstract progression을 나타낼 뿐, 실제 물리적 시간은 아니다.
✅ Methods 핵심
PathDiffusion은
- AFDB50 homolog 구조들로부터 residue별 evolutionary stability signal인 PSNS를 만들고,
- 이를 SE(3) frame-based score diffusion에 넣어
- Stage 1에서는 sequence-guided folding trajectory를 생성하고,
- Stage 2에서는 conditional/unconditional dual-score fusion으로 structured region과 disordered region의 균형을 맞춰 trajectory를 refine하는 방법
(1) PSNS가 folding order의 핵심 prior
MSA만 보는 것이 아니라 MSTA를 만들고, homologous structures 사이의 residue별 structural variation을 이용해 “어떤 residue가 빨리 접힐지”를 noise schedule에 반영
(2) protein structure를 SE(3) frame sequence로 다룸
각 residue를 position과 orientation을 가진 frame으로 표현하고, translation과 rotation을 각각 diffusion
(3) Stage 1은 folding trajectory 생성 단계
Gaussian noise에서 시작해 300-step reverse diffusion을 수행하고, PSNS에 의해 conserved region은 먼저 denoise되고 flexible region은 나중까지 noise를 유지
(4) Stage 2는 dual-score refinement 단계
sequence-conditional score는 native-like folding을 유도하고, unconditional score는 disordered/flexible conformation을 허용
adaptive weight가 residue별로 둘의 비중을 조절
✅ 질문
- PSNS 방식이 생물학적으로 타당한가?
PSNS는 residue마다 “얼마나 빨리 접히게 할지”를 정하는 noise schedule
PathDiffusion은 모든 residue를 똑같은 속도로 denoise하지 않고, residue별로 다르게 denoise
구조적으로 보존적인 residue → noise를 빨리 제거 → 먼저 접힘
구조적으로 가변적인 residue → noise를 오래 유지 → 나중에 접힘 / flexible하게 남음
이 residue별 denoising 속도를 정하는 값이 PSNS, position-specific noise schedule
논문에서는 target sequence에 대해 homologous sequence를 AFDB50에서 찾음
그다음 단순히 MSA만 만드는 게 아니라, homolog들의 predicted structure를 정렬해서 MSTA, multiple structure alignment를 만듦
그리고 homolog structure들 사이에서 residue별 Cα 위치가 얼마나 일관적인지 봄
어떤 residue가 homologous protein들에서 항상 비슷한 위치와 구조를 유지한다면:
“이 residue는 evolution 과정에서 구조적으로 중요하게 보존되었을 가능성이 크다.”
반대로 어떤 residue가 homolog들 사이에서 위치가 들쭉날쭉하면:
“이 residue는 flexible하거나, 구조적으로 덜 고정되어 있거나, folding 후반까지 유동적일 가능성이 있다.”
생물학적으로 타당한 이유
단백질에서 evolutionarily conserved한 부위는 보통 다음 중 하나일 가능성이 높음
- 구조 core를 이루는 부위
- active site나 binding site처럼 기능적으로 중요한 부위
- folding nucleus처럼 early stabilization에 중요한 부위
- secondary structure나 hydrophobic core 형성에 중요한 부위
이런 부위들은 homolog들 사이에서도 구조적으로 비슷하게 유지될 가능성이 높음
-> 그러면 MSTA에서 Cα 위치 variation이 작게 나타남
PathDiffusion은 그런 부위를 “먼저 안정화되는 residue”로 처리
하지만 어디 부분에서 PSNS가 중요하다고 알 수 있나?
-> Ablation 결과
PSNS를 random noise schedule로 바꾸면 success rate가 59.6% → 28.8%로 떨어짐
그리고 N-terminus to C-terminus 순서나 α-helix/β-sheet/loop hierarchy 같은 rule-based schedule을 넣어도 full model보다 훨씬 낮음
“일반적인 물리 규칙이나 random schedule보다, homolog 구조에서 얻은 residue-specific evolutionary signal이 folding pathway를 더 잘 guide한다.”
- Conditional model 과 Unconditional model 이 어떤 흐름으로 쓰일까?
- 실제 generation은 두 stage로 진행됨
(1) Stage 1: conditional model로 folding trajectory 만들기
Stage 1에서는 conditional model만 사용
Step 1 noise
Step 50 일부 local 구조
Step 150 많이 접힌 중간체
Step 300 folded structure
-> 여기서 보존적인 residue는 빨리 denoise되고, flexible residue는 noise가 오래 남음
(2) Stage 2: conditional + unconditional을 섞어서 refine
Stage 2에서는 Stage 1에서 만든 trajectory를 다시 refine
핵심이 dual-score fusion
각 residue마다 weight w를 정하고, conditional score와 unconditional score를 섞음
- w는 어떻게 정하나?
Stage 1 trajectory에서 얻은 정보를 바탕으로 residue별로 정함
(1) 현재 intermediate conformation의 어떤 residue 주변이 Stage 1 final structure와 이미 비슷하면
“이 부분은 잘 접힌 것 같으니 conditional model을 강하게 쓰자.”
장점은 최종 구조를 잘 만든다는 것
단점은 모든 부분을 너무 딱딱하게 native-like하게 만들 수 있다는 것
-> 최종 구조 품질은 좋아질 수 있지만, local unfolding이나 folding intermediate의 다양성이 줄어들 수 있음
(2) 반대로 final structure와 많이 다르거나 flexible해 보이면:
“이 부분은 억지로 native-like하게 밀지 말고, disorder/flexibility를 허용하자.”
장점은 flexible state를 잘 표현한다는 것
단점은 혼자 쓰면 특정 sequence의 native fold로 가는 정보가 부족하다는 것
Stage 2는 둘 사이의 타협
“이미 잘 접힌 core는 conditional model을 따라가게 하고,
아직 flexible하거나 불확실한 region은 unconditional model의 자유도를 허용하자.”
-> 이게 dual-score fusion의 핵심
PSNS는 주로 언제 접히는가를 조절
conditional/unconditional fusion은 주로 얼마나 native-like하게 만들 것인가 vs 얼마나 flexible하게 둘 것인가를 조절
- Unconditional model을 학습시키는 데이터셋은 뭐인가?
CALVADOS coarse-grained simulation에서 얻은 human intrinsically disordered regions, IDRs의 conformational ensemble로 학습
이 unstructured dataset은 약 24,000개 intrinsically disordered region structures로 구성됨
(human proteome의 거의 모든 IDR을 포함)
| 영어 | 한글 의미 | 설명 |
|---|---|---|
| IDR | intrinsically disordered region, 본질적 무질서 영역 | 고정된 구조 없이 흔들리는 단백질 구간 |
| IDP | intrinsically disordered protein, 본질적 무질서 단백질 | 전체적으로 접힌 구조가 뚜렷하지 않은 단백질 |
| coarse-grained simulation | 거친 입자 시뮬레이션 | 모든 원자를 다 보지 않고 단순화해서 움직임을 계산하는 시뮬레이션 |
| CALVADOS | IDR/IDP simulation 모델 | disordered protein의 ensemble을 만들기 위한 coarse-grained 모델 |
IDR은 보통 하나의 stable native structure로 딱 접히지 않고, 여러 expanded/flexible conformations 사이를 움직임
즉, IDR에서는 중요한 것이
“이 sequence가 정확히 어떤 native fold를 만들까?”
라기보다는,
“disordered polymer-like protein segment가 일반적으로 어느 정도 퍼지고, 얼마나 흔들리고, 어떤 거리 분포를 가지는가?”
에 가까움
즉, Unconditional model이 배우는 것
“단백질의 flexible/disordered region은 일반적으로 어떤 구조 분포를 가지는가?”
-> 정답 하나를 배우는 게 아니라, 유연한 구조들의 분포를 배우는 것
- unconditional model 에서 amino acid 를 고려하지 않으면, 모든 flexible 한 경우의 수를 확인하는 것 아닌가?
아미노산 identity를 안 보면 “이 특정 서열의 flexible residue는 이렇게 움직인다”까지는 못 배움
대신, 서열 정보를 모르는 상태에서도, unfolded/disordered protein chain이 물리적으로 말이 되게 가질 수 있는 일반적인 구조 분포를 prior 로 사용하는 것
-> flexible region이 너무 말도 안 되는 구조로 가지 않도록 잡아주는 일반적인 disordered-chain prior
또한, Unconditional은 혼자 쓰이지 않는다
final score = w × conditional score + (1 - w) × unconditional score
즉 flexible하다고 판단된 residue도 완전히 자유롭게 아무 데나 가는 게 아니고, 여전히 주변 folded core, stage 1 trajectory, current conformation의 영향을 받음
그래도 unconditional model은 sequence-dependent disorder physics를 완전히 반영하지 못할 수 있다는 한계는 분명 존재
Gly-rich region은 더 flexible할 수 있음
Proline-rich region은 특정 backbone angle이 제한될 수 있음
charged residue composition이 chain expansion에 영향 줄 수 있음
hydrophobic segment는 local collapse할 수 있음
low-complexity sequence의 phase behavior가 다를 수 있음
- 그러면 왜 논문은 unconditional을 선택했을까?
저자들은 이미 sequence-specific folding 정보는 conditional model이 담당한다고 봄
unconditional model까지 sequence를 강하게 보면, 둘 다 native-like structure 쪽으로 bias될 위험이 있음
특히 PathDiffusion은 local unfolding, IDP ensemble, folding intermediate를 잡고 싶어 하는데, sequence-conditioned model만 쓰면 구조를 너무 final folded state로 끌고 갈 수 있음
그래서 unconditional model에는 일부러 sequence identity를 숨겨서
“이 부분은 특정 native fold로 억지로 끌고 가지 말고, disordered chain으로서 자연스럽게 둘 수 있게 하자.”
라는 역할
conditional model은 지도 앱
“목적지 native structure는 여기야. 이 길로 가.”
unconditional model은 도로 규칙
“길은 이렇게 자연스럽게 이어져야 하고, 차가 벽을 뚫으면 안 되고, 너무 말도 안 되는 움직임은 안 돼.”
