[Paper Review] Comprehensive discovery of m6A sites in the human transcriptome at single-molecule resolution

m6A: N6-methyladenosine

nanopore sequencing

: 단일 핵산 분자가 나노미터 크기 구멍을 통과할 때, 그 순간순간 전류가 어떻게 변하는지를 읽어 염기와 modification을 추론하는 기술

• 구조: [ RNA 본체 ] ─ poly(A) tail ─ adapter ─ motor protein
• 시작점은 poly(A) tail
• adaptor의 한쪽은 poly(A) tail에 화학적으로 결합하고, 다른 한쪽은 motor protein 결합 도메인을 포함한 구조로, motor protein을 RNA와 연결시키는 역할을 함.
• motor protein이 RNA를 nanopore로 천천히 당겨 한 번에 1nt 정도씩 이동시키는 분자 모터 (없으면 분자가 너무 빨리 지나가서 못 읽음)
• Nanopore는 RNA가 통과하면서 생긴 전류 변화를 측정함.
• 전해질 용액 + 전압
  • pore 양쪽에 KCl 같은 이온 용액
  • 이온들이 pore를 통해 흐름. baseline ionic current 형성

이전 기술의 한계점

• antibody-based methods
  • MeRIP-seq, miCLIP: 항체 기반 방식
  • m6A-specific antibodies의 비특이적 결합으로 false positive가 많이 발생함.
• Chemical conversion-based methods
  • m6A-SEAL, m6A-SAC-seq: 화학적 변형 방식
  • 불완전한 화학적 변형(모든 m6A 자리가 다 변형되지 못함)으로 인해 false negatives(맞는데 음성으로 판단)가 많이 발생함.
• Enzyme-based methods
  • DART-seq, m6A-REF-seq: 효소(enzyme) 기반 방식
  • 특정한 서열 모티프에만 반응하는 효소에만 의존해 낮은 감지 민감도를 보임.
• 개별 RNA 분자의 변형 상태를 알 수 없음 → m6A와 다른 biological process와의 상호관계를 파악할 수 없음.
• 훈련 데이터셋의 문제 → whole transcriptome sequencing / in vitro transcription(IVT)
  • 서열 맥락(sequence context)이 극도로 제한됨
  • IVT는 모든 A(adenosine)을 m6A로 바꿔버림.
  • whole transcriptome dataset은 높은 비율로 변형되는 m6A 위치들이 현저히 많이 포함되어있음. → Stoichiometry 강한 편향이 생김.
  • A와 m6A 위치들의 레이블이 정확하지 않음.
• summary statistics를 기반으로 함.(base-calling errors/mean and standard deviation of electric current of DRS) → 손실되는 유용한 정보들이 있을 수밖에 없음.

DeepRM (Deep learning for RNA Modification)

데이터셋

• DeepRM dataset: high quality training-dataset (IVT 데이터셋보다 endogenous transcript environments를 더 반영하고 있음.)

  • chemical oligonucleotide synthesis을 사용해 단일 m6A이면서 주변 염기는 모두 unmodified되게 만듦.
  • single-molecule resolution (detection of RM in individual transcripts)
    → 잘 알려지지 않은 non-canonical m6A, transcrips마다 다른 변형 정도를 파악할 수 있음
    → high-stoichiometry sites에 대한 bias가 없음

• DRS reads가 읽은, m6A와 A가 만들어내는 raw electric currents를 통해 m6A를 구분해냄.
  (using full information)

• m6A 또는 A, 그리고 20개의 unmodified random nucleotides로 구성된 21nt LCB를 이용함. (transformer 모델 이용)

• DRACH motif, non-DRACH motif에 위치하는 m6A 모두 감지할 수 있음.

• low-depth regions(애초에 reads 수가 많지 않은 regions)의 m6A도 정확하게 정량화할 수 있음.

• 21-nt LCB를 이용함.

  • DRS 신호 분석 결과 m6A 하나가 전류 신호에 ±10 nt까지 영향 (최대 21 nt 범위에서 신호 변화)
  • 이전 연구에서는 5-9nt flanking sequence만 사용함. 20nt 이내에 m6A가 두 개 이상 있으면 신호가 overlap되서 서로 간섭되는데 기존 IVT 데이터셋에서는 m6A들 사이의 거리가 20 nt보다 짧은 경우가 많았기에 신호가 섞인 상태로 학습되는 경우가 많았음.
  • 단일 m6A로 인한 신호 변화를 최대한으로 학습해 높은 정확도로 검출 가능함.
    →❓ 대신 20 nt 이내에 m6A가 여러 개 있는 경우에는, 이를 감지하는 것이 어려울 것.

• 3개의 LCB (87-nt oligonucleotides)를 합성해 BB(building block)를 만듦. DRS를 위해, 여러 BB를 한 번에 ligation 시킴. 따라서, 한 read를 12개의 LCB를 ligation 시켜서 300 nts보다 길게 만들어 사용함.

• LCB는 random sequence이고 DNA template 역시 없기 때문에 label을 만들 수가 없음. 또한, DRS 과정에서 발생하는 insertions와 deletions로 인한 해석 오류가 빈번함
  → LCB 사이에 predefined sequences인 6-nt 길이의 spacer를 미리 삽입해둠.

• spacers와 LCB center에 위치하는 A를 기준으로 LCB를 정확하게 재구성할 수 있음.

• accuracy of the template-free LCB reconstruction algorithm
  → Precision: 0.999 / Recall: (A)0.515 , (m⁶A) 0.445

• m6A detection accuracy 비교

  • m6Anet45, Dorado29, and SingleMod (Nanopore-based) 와 DeepRM 비교
  • GLORI47, m6A-SAC-seq18, m6ACE-seq48, miCLIP2 (experimental m6A detection methods)를 ground truth로 사용
  • AU-PR = 0.943 (양성 예측의 실제 신뢰도) / AU-ROC = 0.997 (전체적인 분리 능력)
    👉🏻DRACH (AU-PR = 0.958 and AU-ROC = 0.997)
    👉🏻non-DRACH (AU-PR = 0.715 and AU-ROC = 0.966)

• m6A의 site level뿐만 아니라 m6A의 stoichiometry까지 파악할 수 있음

DeepRM 모델

토큰: 한 시점에서의 복합 신호 묶음

• ⚡normalized electric current
• 🧬basecalled sequence
• ⏱move table (dwell time)
• 🎯 base quality

→ 이걸 벡터(vector)로 바꿔서 Transformer에 넣음

• lower depth(≤20)에서도 뛰어난 성능을 보임
• single-molecule resolution을 제공함. 따라서 co-occurrence까지 확인할 수 있음 (같은 RNA 분자 안에서 여러 m6A가 동시에 존재하는 조합적 패턴)
  → RM과 alternative splicing과의 관계도 찾아내는데 기여할 수 있을 것으로 기대됨.

‼️Confusion Matrix

실제 상태 / 판정 결과	양성이라고 판정	음성이라고 판정
실제로 있음	⭕ True Positive (TP)	❌ False Negative (FN)
실제로 없음	❌ False Positive (FP)	⭕ True Negative (TN)

🟣 Recall(재현율) = Sensitivity(민감도) = TPR
→ 실제 ‘양성’인 것들 중, 모델이 ‘양성’으로 제대로 예측한 비율 → 탐지 능력
→ TP / (TP + FN)

🟣 Specificity(특이도)
→ 실제 ‘음성’인 것들 중, 모델이 ‘음성’으로 제대로 예측한 비율 (정상인을 얼마나 잘 정상이라 했나?)
→ TN / (TN + FP)

🟣FPR (Specificity의 반대)
→ 실제 음성을 양성이라 착각한 비율 (정상인을 얼마나 많이 환자로 오진했나?)
→ 1 − Specificity

🔴Precision(정밀도):
→ 모델이 ‘양성’이라고 예측한 것 중 실제 ‘양성’인 비율 → 예측 정확성
→ TP / (TP+FP)

‼️ROC Curve (Receiver Operating Characteristic)

• x축: FPR / y축: TPR
• threshold를 0→1로 쭉 움직이며, trade-off를 그린 곡선
• “모델이 positive와 negative를 잘 구분하는가?” → 구분 능력
• 목적: 모델 자체의 능력(판별력)을 평가하기 위한 것. 최적의 threshold는 문제 정의, 상황에 따라 달라질 수 있음.

‼️PR Curve (Precision–Recall Curve)

• x축: TPR (Recall) / y축: Precision
• positive라고 잡은 애들, 진짜 쓸 만한가? → 예측의 질

‼️LCB (local sequence context block): Nanopore DRS로 시퀀싱된 21-nt RNA 조각 하나

‼️BB (Building Block): 87-nt oligonucleotides containing three LCBs

‼️LC-MS/MS:

• 액체 크로마토그래피 + 2단 질량 분석
• Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

‼️DRACH (D = A/G/U, R = A/G, and H = A/C/U)