원문 : Liquid biopsy in breast cancer: A comprehensive review (2019)
저널 : Wiley online library:clinical genetics
번역이 아니라 읽고 중요하다 생각되는 부분들을 요약하고, 개념들에 대해 설명하는 것을 목표로 합니다.
Liquid Biopsy
Liquid Biopsy란 기존의 Tissue Biopsy의 invasive한 특성과 cancer의 heterogenity를 커버하지 못하는 단점을 보충하기 위한 수단으로써 사용됩니다. Tissue Biopsy는 cancer resection 과정에서 수행 할 수 있기에 cancer가 어떻게 발전하고 있는지 알기 어렵습니다. 그렇기 때문에 cancer의 development 과정을 추적할 수 없으며, 동일하게 cancer cell이 치료과정에서 registance를 얻게 되는지 역시 알기 힘듭니다. 하지만 Liquid biopsy는 비침습적인 방법으로 Cancer의 Early Detection, Longitudinal Monitoring, relapse 발생 여부, Precision medicine에 사용 될 수 있는 장점이 있습니다.
Liquid Biopsy Components
Liquid biopsy 구성은 Circular Tumor Cells(CTCs), cell free DNA/ cell free RNA, Extracellular Vesicle(EV) 들로 나뉩니다. 이 극미량의 구성요소로 위에서 언급한 테스크들을 수행할 수 있는 잠재력이 있는 것이지요. Liquid biopsy의 샘플 채취는 두가지로, Plasma, Serum 입니다만, Serum은 clotting factor를 제거했기 때문에 백혈구가 그대로 남아 있어 germline DNA가 많이 남아 있습니다. 그러나 Cancer에서는 germline이 중요한게 아니라 somatic이 중요하기 때문에 clotting factor를 제거하지 않은 Plasma를 샘플로 사용하는 것이 선호됩니다.
Circular Tumor Cells(CTCs)
CTC란 Primer 혹은 metastatic tumor로부터 혈관에 들어간 tumor cell들을 말합니다. 일단 CTC가 무엇인지 정의하자면 세포핵을 가지고 있는 세포이며 cytokeratin이 positive stain으로 나타나는 세포입니다. 또한 C11과 A53-B/A2 antibody로 인식할 수 있는 세포이며 보다 큰 cell 형태의 세포입니다.
CTC가 방출되는 것은 tumor cell의 micrometastasis로 인해, 그리고 tumor cell의 성장 과정에서 혈액으로 방출되는 것으로 알려져 있습니다. CTC는 7.5ml의 피당 5개 미만이 있을 경우 환자의 생존률이 올라가는 것으로 알려져 있습니다. 하지만 CTC의 개수를 세는 것은 한계가 있는데, 왜냐하면 CTC의 반감기가 1-4시간 밖에 안되기 때문입니다.
CTC에서 가장 주목을 받는 점은 어떻게 CTC만을 혈액에서 분리하는가입니다. CTC를 분리하는 가장 기본적이고 대표적인 방법은 CTC의 크기가 다른 셀들에 비해 크다는 것을 이용해 분리하는 것입니다. 그 외에도 tumor cell의 표면 분자들을 이용하는 방법이 있기는 합니다. 예를 들면 Epithelial Cell Adhesion Molecule(EpCAM)이 tumor cell에서 발현이 많이 되는 것으로 알려져 있기 때문에 EpCAM을 타겟으로 CTC를 isolation 시키는 것입니다. 하지만 tumor cell이 혈액으로 나오기 위해서는 Epithelial Mesenchymal Transition(EMT)가 일어나야 하는데, EMT가 발생하면 EpCAM이 발현을 안하게 되는 문제가 있습니다. 그래서 결국 CTC를 분리하는 방법으로 CTC의 사이즈를 이용하는 방법으로 되돌아오게 됩니다. 대표적인 방법으로는 Multi-orifice flow fractionation(MOFF), pMOFF가 있습니다.
이렇게 CTC를 분리해 내더라도 문제점은 아직 남아 있습니다. 예를 들면 ER+/PR+ 인 유방암 환자의 CTC에서 ER-/PR- 인 경우도 있으며, HER2+ 인 환자의 CTC에서 HER2- 로 나오는 경우가 있습니다. ER+ 라면 Endocrine Theraphy를 HER2+라면 Trastuzumab과 같은 처방을 해야 할 텐데, CTC만으로는 신중히 처방을 할 필요가 있습니다. 물론 chemotherapy 후의 prognosis를 보는 데는 도움이 될 수 있지만 CTC의 결과로 처방을 하는 것은 정확하지 않을 수 있습니다.
ct/cfDNA
ct/cfDNA 는 혈액 안에 떠다는 DNA들로 건강한 혹은 tumor cell의 Apoptosis 혹은 Necrosis에 의해 혈액에 생기 되며, 특히 ctDNA가 들어간 cell은 형질 전환을 일으켜 metastasis를 발생시키는 것으로도 알려져 있습니다.
cfDNA의 혈액내 농도는 여러가지 변수에 의해 변할 수 있습니다. 암의 진행 과정에 따라 암이 심해질 수록 cfDNA의 농도가 짙어지는 것으로도 알려져 있지만 그 외에도 격한 운동 및 수술에 의해서도 높아 질 수 있습니다. 하지만 대체로 일반적인 사람의 경우에는 특별한 변수가 없을 경우 13ng/mL 이지만 later stage의 암환자의 경우에는 180ng/mL까지 늘어납니다. 이 외에도 cfDNA의 genomic anlaysis는 암에 대한 정보를 알려주는데 중요한 역할을 합니다.
ctDNA는 cfDNA의 일부입니다. ctDNA를 cfDNA에서 골라내는 것은 어렵기는 합니다만 연구결과 길이가 90~150bp정도의 cfDNA를 환자에게서 얻었을 때, 11배 정도의 변이를 관찰 할 수 있는것으로 나타나, cfDNA의 길이를 이용해 ctDNA를 솎아 낼 수 있는것으로 알려져 있습니다.
특히 ctDNA는 cerebrospinal fluid(CSF-척수)에서 중요한 정보를 제공하는데, 왜냐하면 CNS(central nervous system)에 tumor가 있는 경우에 brain-blood barrier에 의해 tumor가 혈액으로 나가는 길이 막혀 있기 때문입니다. 그 외에도 ctDNA는 feces, urine, saliva, pleural effusion에서 다른 타입의 암을 진단하는데 사용 될 수 있습니다.
ctDNA의 분석은 두가지로 나뉘는데 첫번째는 정량적 분석입니다. 정량적 분석은 위에서 언급했던 cfDNA의 농도를 측정하는 것입니다. 다른 하나는 정성적 분석으로 cfDNA의 변이를 분석하는 것입니다. 방법으로는 BEAMing, Safe-SEqS, TamSeq, ddPCR assays를 사용해 SNP를 찾아내는 방법, 혹은 WGS를 이용해 CNV를 찾아내는 방법이 있습니다. 물론 NGS가 전체를 알 수 있는데 도움이 되기는 하지만, liquid biopsy 특성한 매우 매핑시 1X 가 나와 극도로 낮은 allele frequncy가 나오는 단점이 있습니다. 그래서 낮은 allele frequency를 극복하기 위해 unique molecular barcoding을 각각의 DNA에 붙이는 방법이 제안되었습니다.
cfRNA
tumor는 높은 turnover rate 때문에 RNA의 생성이 많을 수 밖에 없습니다. 그래서 tumor cell에는 특정 gene의 발현이 많습니다. 그리고 tumor cell에서 나온 RNA들이 피로 들어오면 이를 cfRNA라고 합니다. cfRNA의 장점은 cfDNA에 비해 양이 많다는 것입니다. 보통 cfRNA는 mRNA와 miRNA로 구성되는데, 대체로 miRNA가 비율이 높습니다.
보통 RNA는 백혈구나 plasma의 nuclease에 degradation 되기 마련이지만, platelet이나 exosome 안에 보관된 mRNA나 miRNA는 degradation을 회피 할 수 있습니다. 특히 platelet은 백혈구로부터 회피하며 tumor의 RNA를 가질 수 있습니다. tumor 의 RNA를 가지고 있는 platelet은 성질이 변화하는데 이를 tumor-educated platelet(TEP)라고 합니다. TEP는 혈관 생성과 metastatic tumor cell의 intravasation을 촉진합니다. 환자들의 TEP를 조사해 본 결과 71% 확률로 tumor의 위치를 파악하는데 성공하여 암 진단 바이오마커로써 기대되고 있습니다. Platelet과 마찬가지로 exocytosis 로 인해 세포 밖으로 방출되는 세포간 신호 전달 vesicle인 exosome 역시 mRNA, miRNA, ctDNA를 가지고 있기 때문에 metastasis에 중요할 것으로 보고 있지만 추가적인 연구가 필요합니다.
Liquid biopsy의 유방암에서의 활용
유방암은 초기에 증상이 없음으로 조기 진단이 중요합니다. 하지만 liquid biopsy를 이용한 조기 진단은 아직 연구가 많이 필요하다고 합니다. liquid biopsy의 cfDNA의 농도를 사용할 경우 stage가 진행이 많이 됬을 경우에 높게 나타나지, stage가 낮을 경우에는 normal과 별 차이가 없기 때문에 사용하기 어렵습니다. 또한 PIK3CA와 같은 유전자는 stage가 진행될 수록 cfDNA ddPCR에서 mutation이 많이 발생하지만, 인간은 노화가 될 수록 mutation이 더 많이 발생하지만, 암과는 연관이 없는 경우도 있기 때문입니다. 그래서 논문에서는 연구가 더 필요하다거나, 다른 진단 방법들과 결합하여 사용할 것을 추천하고 있습니다.
조기 진단 외에도 liquid biopsy는 cfDNA, CTCs를 이용해 재발 모니터링 및 Primary Tumor localization, heterogenity 관츨, tumor의 저항성 등을 예측하는데 사용될 수 있는 가능성을 내포하고 있다고 합니다.
