Astrocytes phagocytose adult hippocampal synapses for circuit homeostatis

https://www.nature.com/articles/s41586-020-03060-3

• 원래는 microglia 만이 synapse elimination 에 관여한다고 알려져 있었음
• astrocytic phagocytosis 도 중요하다는 것을 밝혀냄
• fluorescent phagocytosis reporter 를 개발함
• mCherry-eGFP 를 같이 연결하고, mCherry 는 중성 및 산성에서도 성질을 잘 유지하지만 eGFP는 산성 환경에서 성질을 잘 유지하지 못함.
• 이 두 물질의 성질을 이용해, lysosome 과 같은 소기관에서 mCherry 만 활성화 될 것이라 가정하고 이를 실험적으로 확인했으며, 이를 "glial synase elimination reporter" 로써 활용함.
• astrocyte 가 neuronal activity-dependent elimination of excitatory synapses 의 기능을 수행한다는 것을 밝힘.
• phagocytic receptor MEGF10 이 없는 astrocytes 는 elimination of excitatory synapse 의 감소를 보였고, excessive but functionally impaired synapses accumulation 을 초래함을 확인함.
• Megf10-KO mice 가 long-term synaptic plasticity 및 hippocampal memories formation 에도 defective 함을 보임.

Monitoring glial phagocytosis in vivo

mCherry-eGFP reporter system 을 활용함. (평소엔 붉/초 나타나다가 phagocytic 되면 붉)
구체적으로는 먼저 AAV9 vector & hSYN-driven membrane-bound (lyn) 사용
CA3에 먼저 넣어봤는데 mCherry-eGFP 다 나타남.
하지만 CA1에는 "mChery-alone puncta"가 astrocyte, microgla 에서 발견됨
또, thalamocortical input (LGN쪽) 에는 없었고 hippocampus 쪽에 undergo substantial synapse turnover 때문인듯

Astrocytic phagocytosis of adult synapses

hSYN 은 synapse 전반을 타겟한 promoter 임
synapse 를 excitatory / inhibitory 그리고 presynaptic / postsynaptic structure 를 각각 타겟하는 promoter 뒤에 이 mCherry-eGFP 를 붙임. (ExPre, InhiPre, ExPost, InhiPost)

이 때 이 fusion protein 을 AAV9를 통해 CA1 이나 CA3 에 넣으면 ex/in synapses in CA1 에 exclusively 나왔음. 특히 CA1 의 glial process 에서 나타남.

아래 figure 를 보면, mCherry alone signal 이 대부분 microglia (IBA1) 나 astrocyte (S100B) co-localization 되는 것을 확인할 수 있음. (소화 중)
반대로 mCherry-eGFP 는 각 synaptic protein 과 co-localize 됨. (소화 전)

3D rendering 을 통해 확인

특히 inhibitory synapse 보다 excitatory synapse 에서 phagocytosed synapse 를 많이 관찰할 수 있었음. (immunohistochemistry 결과에서도 excitatory synapse 관련 protein 이 glial cell 내부에서 더 많이 발견됨.)

이러한 결과는 excitatory synapses 가 glial phagocytosis 의 main target 임을 암시

또 excitatory 이든 inhibitory synapse 이든 microglia 보다 astrocyte 에서 mCherry-alone puncta 가 더 발견됨. astrocytes participate more actively in eliminating synapses during nomral synaptic turnover in the adult CA1

더 구체적으로, 93% of mCherry-alone puncta 는 lysosomes 에 있었고 4.6% of mCherry-eGFP puncta 만이 lysosome 안에 있었음.
아래 그림에서 Cathepsin D 는 lysosome 을 타겟하는 물질임. confocal image 에서 lysosome 안을 확인해보니, mCherry-alone 이 lysosome 안에 있는 것을 확인. 이와 달리 endosome 안에는 비슷한 양의 mCherry-alone, mCherry-eGFP puncta 가 있는 것을 확인함. 몇몇 경우에는 mCherry-alone (소화 중) 과 synaptic protein 이 같이 발견되는 것도 확인했는데 이는 engulfed 된지 얼마 안된 material 임을 암시한다. (이건 extended fig 2b, d, f, h)

이러한 발견들은 뒤에서 저 자세히 설명하겠지만 AAV reporter 로 인한 synaptic property change 때문이 아니다. sEPSC, sIPSC 나 다른 property 를 확인했을 때 정상임을 확인했다. (뒤에 여러 근거)

Together, these data indicate that our analysis represents endogenous synapse turnover in the adult hippocampus, and that astrocytes contributes to this process by constantly phagocytosing synapses.

Activity-induced synapse elimination

쥐가 무언가를 학습할 수 있는 enrichment chambers 를 만듦. (for 2 or 7 days)

두 그룹 모두 control 그룹에 비해 증가된 c-Fos-positive (학습 관련) cells in CA1 를 보임.
근데 astrocytic uptake of inhibitory synapse 랑 microglial uptake of either exicatatory or inhibitory synapse 의 증가는 증가하지 않음.
Only ExPre, ExPost 에서만 uptake increasae 를 보임.
(직접 쓰여있지는 않지만, mCherry alone 영역을 구한 것임)

이거를 AAV9 reporter 방식이 아닌 non-viral method, electroporation 으로도 다시 한번 확인해봄. ExPre along with fluorescence-tagged hSYN (hSYN-tagBFP) in hippocampal CA3 neurons.

그림을 보면 tagBFP 근처, 즉 각각의 individual terminal and en passant boutons 에서 astrocytic or microglial process (S100B, IBA1 co-localization) 의 signal 인 mCherry-alone signal 이 보임.

또한 간혹 axon 내부에서도 mCherry-alone signal 이 보였는데 이러한 signal 을 recycle 이라 보고 따로 quantification 을 해서 나타내었음. 결과 engulfed synapse 에 대해서 significant increase 를 다시 확인함.

이러한 결과는 neuronal activity selectively increases phagocytosis of excitatory synapses by astrocytes, and potentially mediates activity-dependent synaptic turnover and plasticity 임을 암시함.

MEGF10-dependent synapse phagocytosis

to test whether phagocytosis by astrocytes is involved in synapse engulfment in the adult hippocampus...

loxP-floxed Megf10 (Megf$10^{fl/fl}$) mice 만들어서 Cre-dependent manner 로 KO 시킬 수 있도록 함. 특히 Inducible deletion 은 Aldh1l1-creERT2:Megf$10^{fl/fl}$ mice 와 이것에 4OHT (4-hydroxy tamoxifen) 을 주입하는 것으로 이루어짐 --> astrocyte-specific conditional Megf10 knockout: acMegf10 KO

immunohistochemistry 와 western blot 을 활용해서 astrocyte 가 acMegf10 KO mice 에서 showed no changes in number or areas of territory 임을 보임.

AAV reporters 를 acMegf10 KO mice 에게 주입했을 때 excitatory synapse engulfment 의 유의미한 감소를 확인함. 하지만 inhibitory synapse 에서는 이러한 유의미한 감소를 찾지 못했고, 이는 MEGF10 을 이용하는 astrocytes 는 adult hippocampuse 에서 excitatory synapse 만 특이적으로 제거한다는 것을 보임.

또한, astrocyte 가 아닌 microglia 의 engulfed excitatory synapse 개수는 변함이 없었고, 이는 microglia do not compensate for the reduced phagocytic function of astrocyes in the adult hippocampus 임을 암시함.

Roles of MEGF10 in circuit homeostasis

to investigate whether astrocytes use MEGF10 for phagocytosis to control synapse numbers in the adult hippocampus...

acMegf10 KO mice 에서 excitatory synapse 와 inhibitory synapse 개수를 측정함. (구체적으론, confocal image 에서 pre/post signal co-localization 을 count)

excitatory synapse 개수는 증가했지만 inhibitory synapse 개수는 증가하지 않음.
emphasizing the role of MEGF10 in eliminating exciatory synapses

좀 더 구체적으로, GFAP - eGFP (control), GFAP - Cre-recombinase - eGFP (KO) 로 실험을 설계해서, eGFP+ (즉 MEGF10 가 이제 없는 astrocyte) territory 와 eGFP- territory 에서의 excitatory synapse 개수를 비교했는데, 후자에서만 유의미한 증가를 보였음. 즉 accumulation of excitatory synapse 를 더 특이적으로 확인함.

이후 serial section transmission electron microscopy (ssTEM) 기술을 활용해서 acMegf10 KO mice 가 더 많은 excitatory synapse 와 spine synapses 를 가짐을 확인하였음.

spine synapse 를 더 세분화 해서, multiple synaptic bouton (MSB), multiple synaptic spine (MSS) 로 나눴을 때 둘 다 늘었음.

또한 lack of MEGF10 떄문에 생긴 basal synaptic transmission 변화를 측정하기 위해, sEPSC, sIPSC 를 CA1 pyramidal neurons 으로부터 측정함.

average sEPSC frequency 는 두배 이상으로 늘었지만, sIPSC frequency 나 amplitude of sEPSC, sIPSC 의 변화는 없었음. 또 추가로 AMPA/NMDA receptor ratio 도 살펴보았는데 변화 없었음. 이는 excitatory postsynaptic "functions" 자체는 astrocytic phagocytosis 에 영향을 받지 않았음을 암시함.

또 sEPSC frequency 의 증가는 synapse 개수 증가 또는 increase in presynaptic release 때문일 수도 있기 때문에, field excitatory postsynaptic potential (fEPSP) 를 측정하였고 이를 통해 paired pulse ratio (PPR) 가 유의미하게 증가했음을 확인하였음. implying reduced presynaptic release of neurotransmitter.

즉 sEPSC frequency 증가는 synapse 개수 증가 때문이라는 주장에 대한 설득력 강화

(부연 설명, PPR 은 한 번 자극 주고 두번째 자극 줬을 때 첫 반응과 두번째 반응 ratio
인데, PPR 이 증가했다는 뜻은 neurotransmitter 초기 방출 후 남은 neurotransmitter 양이 충분하다는 것을 뜻하고, 이는 전반적인 neurotransmitter 방출의 감소와 관련이 있음.)

이와 비슷하게 the number of docked vesicles located near presynaptic terminals 를 측정했는데 이것 또한 MEGF10 KO mice 에서 감소됨. 쓸데없는 excitatory synapse 에 vesicle 다 갖다쓰니까 여기에서 사용할 애가 없는 것.

이러한 자료들을 봤을 때

• normal excitatory synaptic onnectivity requires constant regulation by MEGF10-dependent astrocytic phagocytosis
• homeostatic downregulatino of presynaptic release to compensate for the presence of excess synapses and increased excitatory network activity

Roles of MEGF10 in plasticity and memory

tested whether hippocampal long-term potentiation & depression was affected by deletion of Megf10...

(자세한 내용은 생략)

실제 쥐의 인지 기능에도 Megf10 deletion 이 부정적인 영향을 미침.

재밌다..