✅ 연구 목표
1️⃣ 문제의식
나노바디는 항체보다 작고 안정적이지만, 열안정성은 개별 분자마다 큰 차이를 보이며,
응용 시 안정성이 낮으면 단백질이 변성되고 약효가 떨어짐.
2️⃣ 목표
특정 SARS-CoV-2 나노바디(Nb20)를 기반으로 열안정성을 향상시키되, 항원 결합능력(affinity)을 유지하는 것을 목표로 함.
🖐 Nanobody 란?
나노바디는 4개의 FR + 3개의 CDR로 구성된 단순한 구조
1️⃣ 항체보다 작고, 복잡도가 낮음
이는 단백질이 접히기 쉬운 구조를 의미함
→ 덜 변형되고 더 안정적
2️⃣ 열, pH, 유기용매 등 극한 조건에서도 구조 붕괴가 덜 일어남
설령 변성이 되더라도 다시 제자리에 잘 접힘 (refolding capacity)
3️⃣ FR의 아미노산 조성이 수용성 증가에 기여
E49, R50, D62, K65, R67, R72, K76, E89
이 아미노산들 대부분은 친수성(hydrophilic)이거나 음전하(−) 또는 양전하(+)를 띔
수용액에서 잘 용해됨
→ 덩어리지거나 응집(aggregation)될 위험이 적음
→ 구조 안정성 증가
4️⃣ 이황화 결합(disulfide bond)의 역할
나노바디의 중요한 구조적 특징 중 하나는 C23–C104 사이의 이황화 결합
이 결합은 단백질을 “고정”시켜 구조적 유연성을 제한하고, 안정화를 유도함
어떤 나노바디에서는 추가적인 이황화 결합도 존재
→ 더 높은 안정성 제공 가능
✅ 나노바디의 Tm 다양성 원인
✅ 주요 원인
1️⃣ 아미노산 서열 차이
구조적 요소들(2차 구조, 수소결합망, 소수성 분포 등)에 영향을 줘서 Tm 변화 유발
2️⃣ CDR과 FR 간의 구조적 불일치
접힘이 제대로 안 되거나,
필수적인 내부 상호작용이 손실되어 안정성이 급격히 낮아짐
✅ 기존 접근법
✅ CDR Grafting
항원 특이성을 유지하는 CDR을 더 안정적인 FR에 이식하는 전략
문제점: 구조 불일치로 안정성, 발현 저하 가능
✅ 이황화결합 추가
구조 안정화 전략으로 이황화 결합 도입이 효과적임을 시사
ex)
A4.2m: lama 기반 A4.2의 안정화 버전
A54C–I78C 이황화결합 추가 → Tm +8.9°C 증가
주의사항: 이황화 결합 도입은 위치나 개수에 따라 예측이 어려움
→ 항원 친화도나 발현성에 영향 줄 수 있음
✅ 논문의 전략
✅ 구조
- CDR: Nb20 (SARS-CoV-2 spike protein 결합 나노바디)
- FR: A4.2m (93.6°C Tm, 안정 scaffold)
✅ In Silico Saturated Mutagenesis
FR1~4의 모든 비-cysteine 위치에 point mutation 적용
4개의 계산 툴 사용
- I Mutant
- FoldX
- Rosetta
- ThermoMPNN
각 돌연변이에 대해 ΔΔG 예측 → 안정화 가능성 높은 돌연변이 선별
✅ 연구 방법 요약
1️⃣ CDR Grafting (CDR 이식)
Nb20 (SARS-CoV-2 S protein 결합 나노바디)의 CDR를
A4.2m이라는 안정적인 라마 유래 나노바디의 framework region(FR)에 이식함.
생성된 나노바디를 Nb20−4.2m이라고 명명.
결과:
Tm(용해온도)가 50 → 60°C 증가
refolding rate(변성 후 다시 접히는 비율): 39% → 94%
항원결합능력(Kd): 2.85 → 2.57 nM (변화 없음)
2️⃣ In Silico Mutagenesis Screening (컴퓨터 기반 돌연변이 설계 및 스크리닝)
Nb20–4.2m의 FR1~4 모든 아미노산에 대해 cysteine 제외하고 단일 아미노산 치환 (point mutation) 수행
I Mutant, FoldX, Rosetta, ThermoMPNN으로 ΔΔG (안정화 에너지 변화) 예측
→ 총 31개 고안정성 돌연변이 선별 (3개 이상 툴에서 안정화 예측)
특이사항:
대부분의 돌연변이는 친수성→소수성 아미노산 치환이었음.
이는 수소결합 네트워크와 구조적 패킹을 강화하기 위한 전략.
✅ Heatmap 시각화 (Fig 2A–D)
빨간색: 안정화 효과 있는 돌연변이
파란색: 불안정화 돌연변이
→ Fig 2A~D는 각각 툴 별 예측 결과를 시각화
✅ 요약 수치 (Fig 2E–F)
전체 예측된 안정화 mutation 수:
- I Mutant: 139
- FoldX: 102
- Rosetta: 148
- ThermoMPNN: 123
변이가 일어난 위치 수 (mutated site 개수):
대략 31~46개 site
→ 한 위치에서 여러 다른 안정화 돌연변이가 나올 수 있음
✅ 교차 분석 (Fig 2G)
4개 툴 중 최소 3개 이상이 안정화라고 판단한 돌연변이만 선택
총 31개 high-confidence mutations 선정
하나의 도구만 사용했을 때는 이 경향이 일관되지 않음.
즉, 여러 도구를 병합해서 예측할수록 신뢰도 높은 안정성 향상 패턴을 찾을 수 있다는 것.
✅ 돌연변이 위치 분포 (Fig 2H)
FR1~FR4 모두에 걸쳐 분포:
특히 FR4에 가장 많음 (15개)
✅ 아미노산 치환 특성 분석 (Fig 2I)
대부분 친수성(hydrophilic) 아미노산 → 소수성(hydrophobic) 아미노산 치환
→ 내부 수소결합 강화 및 소수성 core 형성 가능성 시사
단백질 내부 코어를 더 단단히 고정해주어 열에 더 잘 견디는 구조를 만들기 때문
소수성 상호작용은 단백질 내부에서 물 분자를 차단하고, 접힘 구조를 더 단단하게 유지시킴.
ex) Glu, Asp, Lys 같은 친수성 → Leu, Ile, Val 같은 소수성
3️⃣ Dot Blot 기반 실험 스크리닝
✅ 실험 설계
Flag-tagged nanobody를 small scale로 E. coli에서 발현
✅ Dot blot으로 다음 특성 평가:
- 발현량 (crude lysate)
- 용해도 (soluble fraction)
- 열 안정성 (60~90°C 가열 후 남아있는 비율)
✅ 분석 결과 (Fig 3A–B)
일부 돌연변이 발현량: Nb20–4.2m 대비 47%~196%
열처리 후 용해성 유지율: 상온 → 60~90°C → 상온 복귀 후 → dot blot
10개 돌연변이가 모든 온도에서 더 높은 유지율
✅ 최종 10개 선별 돌연변이
| 변이 | 위치 |
|---|---|
| R19M, R19L | FR1 |
| R43M, R43L | FR2 |
| Q80L, Q80V | FR3 |
| S83N | FR3 |
| Q112Y, T114V, T114W | FR4 |
4️⃣ 복합 돌연변이 설계 및 평가
이 중 2~3개를 조합한 variant도 제작
- Tm 최대 68°C 달성 (Nb20 대비 +18°C 상승)
- refolding rate는 단일 돌연변이보다 감소 (82% 이하)
✅ 트레이드오프 관찰됨:
Tm ↑ vs Refolding ↓ → 안정성 극대화와 재접힘 효율 사이 균형 필요
5️⃣ 항원 결합능 평가
Tm 및 안정성 향상에도 불구하고 binding affinity는 보존됨
특히 복합변이들도 대부분 2–5 nM 범위 유지 → 기능성 유지됨
6️⃣ 분자역학 시뮬레이션 (Molecular Dynamics)
분석 대상:
- Nb20 (원본)
- Nb20–4.2m (CDR grafted)
- Nb20–4.2m-R19L/R43L/S83N (triple mutant)
1️⃣ RMSD (Root Mean Square Deviation)
구조 전체의 평균적인 변동 정도를 나타냄
→ 클수록 구조가 흐트러지고 불안정하다는 의미
- Nb20: RMSD fluctuation 크고, 표준편차 0.012
- Nb20–4.2m: 0.006
- Triple mutant: 0.008
✅ 결과:
원본 Nb20이 가장 구조적으로 불안정
변이체들은 열에 노출되어도 구조가 잘 유지됨
2️⃣ Rg (Radius of Gyration)
단백질의 구조 압축도 → 분자가 얼마나 조밀하게 패킹되어 있는지
→ 값이 클수록 퍼져 있고, 작을수록 조밀함
- Nb20: Rg 값 변화 1.369 ~ 1.382, 진동 폭 큼
- 변이체들: 변화 점진적, 비교적 일정한 증가
✅ 결과:
Nb20은 온도에 따라 패킹이 쉽게 풀림
변이체는 조밀한 구조를 유지함 → 열 안정성↑
3️⃣ RMSD-based Cluster Distance
구조 군집 사이의 거리 변화 → 구조가 얼마나 불규칙하게 변하는지
- Nb20: 클러스터 간 거리 변동이 심함
- 변이체: 더 안정된 RMS 분포, 진동 적음
✅ 결과:
원본은 다양한 구조 간에 왔다갔다 → 불안정
변이체는 일정한 구조 유지 → 안정적
4️⃣ RMSF (Root Mean Square Fluctuation)
잔기(residue) 단위에서의 유연성
→ 특정 영역이 흔들리는 정도 측정
- Nb20: 큰 구조 변동 → 매우 유연
- 변이체들: 변동 감소, 구조적 견고함 확보
✅ 결과:
변이체는 핵심 골격 영역에서 구조가 고정되어 있음
→ 온도 상승에도 backbone이 흐트러지지 않음
5️⃣ 수소결합 수 (Intramolecular Hydrogen Bonds)
| 항목 | 평균 수소결합 수 (범위) |
|---|---|
| Nb20 | 78.9 (76.4 ~ 80) |
| Nb20–4.2m | 86.4 (83.4 ~ 88.8) |
| Triple mutant | 85.2 (83.2 ~ 86.5) |
특히 변이체는 온도 상승 시에도 점진적 감소
↔ Nb20은 불규칙하거나 급격한 변화
✅ 결과:
구조 안정성 향상 메커니즘은 수소결합 네트워크 강화
- backbone 고정
- 유연성 감소
- 구조 조밀도 증가
- 고온에서 구조 유지력 증가
💡 즉, R19L, R43L, S83N 등의 변이가
특정 수소결합을 유도하거나 유지함으로써
전체 단백질의 구조적 일관성과 내열성을 높였다는 분자 수준의 근거가 제시
수소결합 수 많을수록 구조 유지에 유리
변이체들은 수소결합 네트워크가 더 발달됨
→ 열에 덜 민감함 → 안정성 높음
추가된 소수성 돌연변이 → 수소결합 수 증가 → 구조 안정성 강화
✅ Molecular Dynamics 시스템 준비
1️⃣ 시뮬레이션에 사용된 구조
-
Nb20 구조: RCSB Protein Data Bank에서 다운로드함 (PDB ID: 7JVB).
-
Nb20–4.2m 및 3중 돌연변이체(R19L/R43L/S83N): ColabFold v1.5.5를 사용하여 예측
✅ 말단 안정화 및 이황화 결합 추가
N-말단: 아세틸기(ACE)로 캡핑.
C-말단: N-메틸기(NME)로 캡핑.
이황화 결합: PyMOL을 사용하여 수동으로 모델링 및 추가하여 구조를 안정화함.
2️⃣ 시뮬레이션 조건 설정
수용액 환경 구축
- 수소 원자 추가 후 pH 7.4에서 프로톤화 상태 지정.
- TIP3P 물 모델을 사용해 1.5 nm 큐브 박스에 물 분자 채움.
- Na⁺ 혹은 Cl⁻ 이온을 넣어 100 mM 이온 농도로 맞춤.
- 온도 범위: 300K ~ 370K, 10K 간격 (총 8가지 조건).
- 압력 유지: 실험 내내 1 bar로 고정.
- 에너지 최소화는 GROMACS 2024.5 사용 + CHARMM36-jul2022 force field로 수행.
시뮬레이션 전 평형화(Equilibration)
2단계로 나뉨:
- NVT (온도 일정) 평형화: 100 ps 동안 V-rescale thermostat 사용.
- NPT (압력 일정) 평형화: 100 ps 동안 Berendsen barostat 사용.
각 온도 조건(300K~370K)마다 평형화를 따로 수행.
RMSD와 온도 변동을 확인해 각 상태가 안정되었는지 점검.
3️⃣ 본 시뮬레이션 실행 (Production Run)
- 총 10 ns 동안 시뮬레이션.
-타임스텝: 2 fs. - 데이터 저장: 매 100 ps마다 저장.
- 온도 제어: V-rescale thermostat.
- 압력 제어: Parrinello–Rahman barostat.
4️⃣ 분석 방법
PyMOL 사용:
- RMSD (구조 변화량)
- Rg (radius of gyration, 분자의 조밀도)
- RMSF (잔기별 유연성)
수소 결합 수 계산:
- 온도에 따른 hydrogen bond의 변화 양상 분석
- 구조 안정성과 유연성의 상관관계 파악
🖐 A4.2m 나노바디
일반적인 라마 나노바디들과는 달리
A4.2m은 다른 나노바디들과 구조적/화학적으로 특이한 특성이 있음
1️⃣ 추가적인 이황화 결합(disulfide bond)을 가지고 있음
일반적으로 나노바디에는 C23–C104 사이의 한 개의 보존된 이황화 결합이 존재하지만,
A4.2m은 하나 이상의 추가 이황화 결합을 형성함
→ 단백질 구조 고정력 ↑, 안정성 ↑
2️⃣ 음전하를 띠는 아미노산인 E (Glutamic acid)가 5번과 89번 위치에 있음.
음전하(-)가 많아질수록 물에 잘 녹고, 응집(aggregation)이 덜 생김
→ 용해성 ↑, 안정성 ↑
3️⃣ Q39 (Glutamine)은 중성이지만 문맥상 "positive residue가 적다"는 말로, 전체적으로 양전하가 줄어들었다는 뜻
양전하가 많으면 수소결합을 너무 강하게 하거나, 엉겨붙을 수 있음
→ 안정성에 불리할 수 있음
4️⃣ 효과
Tm (melting temperature) = 단백질이 변성되는 온도
→ 높아짐
Refolding capacity = 열에 의해 변성되더라도 다시 제대로 접히는 능력
→ 향상됨
